Microinjeções ventriculares cerebrais de lipopolissacarídeo em peixe-zebra larval para avaliar a neuroinflamação e a neurotoxicidade

A neuroinflamação tem sido descrita como um fator antineurogênico crucial envolvido na patogênese de várias doenças neurodegenerativas do sistema nervoso central (SNC)¹. Após insultos patológicos, a neuroinflamação pode resultar em várias consequências adversas, incluindo inibição da neurogênese e indução da morte celular neuronal ^2,3. No processo subjacente à resposta à indução da inflamação, múltiplas citocinas inflamatórias (como TNF-α, IL-1β e IL-6) são secretadas no espaço extracelular e atuam como componentes cruciais na morte dos neurônios e na supressão da neurogênese ^4,5,6.

A microinjeção de mediadores inflamatórios (como IL-1β, L-arginina e endotoxinas) no cérebro pode causar redução das células neuronais e neuroinflamação ^7,8,9. O lipopolissacarídeo (LPS, Figura 1), endotoxina patogênica presente na parede celular de bactérias Gram-negativas, pode induzir neuroinflamação, exacerbar a neurodegeneração e reduzir a neurogênese em animais¹⁰. A injeção de LPS diretamente no SNC do cérebro de camundongos aumentou os níveis de óxido nítrico, citocinas pró-inflamatórias e outros reguladores¹¹. Além disso, a injeção estereotáxica de LPS no ambiente cerebral local pode induzir a produção excessiva de moléculas neurotóxicas, resultando em comprometimento da função neuronal e subsequente desenvolvimento de doenças neurodegenerativas 10,12,13,14,15. No campo da neurociência, observações microscópicas ao vivo e em curso temporal de processos celulares e biológicos em organismos vivos são cruciais para a compreensão dos mecanismos subjacentes à patogênese e à ação farmacológica¹⁶. No entanto, a imagem ao vivo de modelos de neuroinflamação e neurotoxicidade em camundongos é fundamentalmente limitada pela profundidade limitada de penetração óptica da microscopia, o que impede a imagem funcional e a observação ao vivo dos processos de desenvolvimento^17,18,19. Portanto, o desenvolvimento de modelos alternativos de neuroinflamação é de grande interesse para facilitar o estudo do desenvolvimento patológico e do mecanismo subjacente à neuroinflamação e neurodegeneração, por meio de imagens ao vivo.

O peixe-zebra (Danio rerio) emergiu como um modelo promissor para estudar a neuroinflamação e a neurodegeneração devido ao seu sistema imunológico inato evolutivamente conservado, transparência óptica, grande tamanho da embreagem embrionária, tratabilidade genética e adequação para imagens in vivo 19,20,21,22,23 . Protocolos prévios injetaram diretamente LPS na gema e no ventrículo rombencéfalo de larvas de peixe-zebra sem avaliação mecanicista, ou simplesmente adicionaram LPS à água de peixes (meio de cultura) para induzir uma resposta imune sistêmica letal^24,25,26,27. Neste trabalho, desenvolvemos um protocolo para microinjeção de LPS nos ventrículos cerebrais, para desencadear uma resposta imune inata ou neurotoxicidade nos 5 dias pós-fertilização (dpf) larvas de peixe-zebra. Essa resposta é evidenciada pela perda de células neuronais, déficit de comportamento locomotor, aumento da liberação de óxido de nitrito, ativação da expressão gênica inflamatória e recrutamento de neutrófilos no cérebro do peixe-zebra 24 h após a injeção.