Voorbereiding, kenmerken, toxiciteit en werkzaamheid Evaluatie van het nasale zelfgeassembleerde nano-emulsietumorvaccin in vitro tr in vivo

Als een van de meest kritieke innovaties op het gebied van de volksgezondheid spelen vaccins een sleutelrol in de strijd tegen de wereldwijde last van menselijke ziekten¹. Op dit moment worden bijvoorbeeld meer dan 120 kandidaat-vaccins voor COVID-19-ziekten getest, waarvan sommige in veel landen zijn goedgekeurd². Recente rapporten stellen dat kankervaccins de voortgang van klinische kankerbehandelingen effectief hebben verbeterd omdat ze het immuunsysteem van kankerpatiënten sturen om antigenen te herkennen als lichaamsvreemd³. Bovendien kunnen meerdere T-cel epitopen binnen of buiten tumorcellen worden gebruikt om peptidevaccins te ontwerpen, die voordelen hebben aangetoond bij de behandeling van gemetastaseerde kankers vanwege het ontbreken van de significante toxiciteit geassocieerd met radiotherapie en chemotherapie ^4,5. Sinds het midden van de jaren 1990 zijn preklinische en klinische proeven voor tumorbehandeling voornamelijk uitgevoerd met behulp van antigeenpeptidevaccins, maar weinig vaccins vertonen een adequaat therapeutisch effect op kankerpatiënten⁶. Bovendien hebben kankervaccins met peptide-epitopen een slechte immunogeniciteit en onvoldoende leveringsefficiëntie, wat te wijten kan zijn aan de snelle afbraak van extracellulaire peptiden die snel diffunderen vanaf de plaats van toediening, wat leidt tot onvoldoende antigeenopname door immuuncellen⁷. Daarom is het noodzakelijk om deze obstakels te overwinnen met vaccinafgiftetechnologie.

OVA 257-264, het MHC klasse I-bindende_257-264 epitoop uitgedrukt als een fusie-eiwit, is een veelgebruikt model epitoop⁸. Bovendien is OVA_257-264 cruciaal voor de adaptieve immuunrespons tegen tumoren, die afhankelijk is van de cytotoxische T-lymfocytenrespons (CTL). Het wordt gemedieerd door antigeenspecifieke CD8 ⁺ T-cellen in de tumor, die worden geïnduceerd door het OVA_{257-264-peptide} . Het wordt gekenmerkt door onvoldoende granzyme B, dat wordt vrijgegeven door cytotoxische T-cellen, wat leidt tot de apoptose van doelcellen⁸. Vrije toediening van OVA_{257-264-peptiden} kan echter weinig CTL-activiteit induceren omdat de opname van deze antigenen plaatsvindt in niet-specifieke cellen in plaats van antigeen-presenterende cellen (APC’s). Het tekort aan geschikte immuunstimulatie resulteert in CTL-activiteit⁵. Daarom vereist de inductie van effectieve CTL-activiteit aanzienlijke vooruitgang.

Vanwege de barrière van epitheelcellen en de continue afscheiding van slijm, worden vaccinantigenen snel verwijderd uit het neusslijm ^9,10. Het ontwikkelen van een efficiënte vaccinvector die door het slijmvliesweefsel kan gaan, is cruciaal omdat de antigeen-presenterende cellen zich onder het mucosale epitheel⁹ bevinden. Intranasale injectie van vaccins induceert theoretisch mucosale immuniteit om mucosale infectie te bestrijden¹¹. Bovendien is nasale toediening een effectieve en veilige toedieningsmethode voor vaccins vanwege het gemak, het vermijden van darmtoediening en verbeterde patiëntcompliancy⁷. Daarom is nasale toediening een goed toedieningsmiddel voor het nieuwe peptide epitoop nanovaccin.

Verschillende synthetische biomaterialen zijn ontworpen om epitopen van cel-weefsel en cel-cel interacties te combineren. Bepaalde bioactieve eiwitten, zoals Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV), zijn geïntroduceerd als onderdeel van de structuur van de hydrogel om bioactiviteit^{te verlenen 12}. Dit peptide draagt waarschijnlijk bij aan celaanhechting, migratie en uitgroei¹³ en bindt integrinen α 3β1 en α_6β1 om te interageren met verschillende kankerceltypen. IKVAV is een celadhesiepeptide afgeleid van het laminine keldermembraaneiwit α_1-keten dat oorspronkelijk werd gebruikt om de neurale micro-omgeving te modelleren en de neuronale differentiatie^{te veroorzaken 14}. Daarom is het vinden van een efficiënt leveringsmiddel voor dit nieuwe vaccin belangrijk voor ziektebestrijding.

Recent gerapporteerde emulsiesystemen, zoals W805EC en MF59, zijn ook samengesteld voor de toediening van de neusholte van geïnactiveerd influenzavaccin of recombinant hepatitis B-oppervlakteantigeen en geïllustreerd om zowel mucosale als systemische immuniteit te activeren¹⁵. Nano-emulsies (NE’s) hebben de voordelen van eenvoudige toediening en gemakkelijke co-vorming met effectieve adjuvantia in vergelijking met deeltjesslijmvliesafgiftesystemen¹⁶. Van nano-emulsievaccins is gemeld dat ze het allergische fenotype op een duurzame manier veranderen die verschilt van traditionele desensibilisatie, wat resulteert in langdurige onderdrukkende effecten¹⁷. Anderen meldden dat nano-emulsies in combinatie met Mtb-specifieke immunodominante antigenen krachtige mucosale celresponsen konden induceren en significante bescherming konden bieden¹⁸. Daarom werd een nieuw intranasaal zelfgeassembleerd nanovaccin met het synthetische peptide IKVAV-OVA 257-264 (I-OVA, het peptide bestaande uit IKVAV gebonden aan OVA_257-264) ontworpen. Het is belangrijk om dit nieuwe nanovaccin systematisch te beoordelen.

Het doel van dit protocol is om systematisch de fysisch-chemische kenmerken, toxiciteit en stabiliteit van het nanovaccin te evalueren, te detecteren of de opname van antigeen en beschermende en therapeutische effecten worden versterkt met behulp van technische middelen, en de belangrijkste experimentele inhoud uit te werken. In deze studie hebben we een reeks protocollen opgesteld om de fysisch-chemische kenmerken en stabiliteit te bestuderen, de omvang van de toxiciteit van de I-OVA NE voor BEAS-2B-cellen door CCK-8 te bepalen en het antigeen-presenterende vermogen van BEAS-2B-cellen voor het vaccin te observeren met behulp van confocale microscopie, de afgifteprofielen van dit nieuwe nanovaccin in vivo tr in vitro te evalueren, en detecteer het beschermende en therapeutische effect van dit vaccin met behulp van een E.G7-OVA tumordragend muismodel.