포유류 숙주에서 활성 감염 중 칸디다 알비칸스 돌연변이 균주에서 형태형성 표현형을 스크리닝하기 위한 생체 내 이미징 사용
Özet
이 원고는 비침습적 공초점 현미경을 사용하여 포유류 숙주에서 활성 감염 동안 형태 형성 표현형에 대해 중간 크기의 칸 디다 알비칸스 돌연변이 라이브러리를 스크리닝하는 방법을 설명합니다.
Abstract
칸디다 알비 칸스는 중요한 인간 병원체입니다. 형태 학적 형태 사이를 전환하는 능력은 발병 기전의 핵심입니다. 이러한 형태학적 변화는 환경 자극에 반응하여 제어되는 복잡한 신호 네트워크에 의해 조절됩니다. 이러한 조절 성분은 고도로 연구되었지만 거의 모든 연구에서 다양한 체외 자극을 사용하여 필라멘트를 유발합니다. 병인 과정에서 형태 형성이 어떻게 조절되는지 확인하기 위해 우리는 포유류 숙주 내에서 균사 형성을 겪는 유기체의 높은 공간 해상도 이미지를 얻기 위해 생체 내 현미경 시스템을 개발했습니다. 여기에 제시된 프로토콜은 이 시스템을 사용하여 C. albicans의 돌연변이 균주의 작은 컬렉션을 스크리닝하여 감염 부위에서 발생하는 형태 형성의 주요 조절자를 식별할 수 있도록 하는 방법을 설명합니다. 대표적인 결과가 제시되어 전사 조절자 Efg1과 같은 형태 형성의 일부 조절자가 시험관 내 및 생체 내에서 일관된 표현형을 갖는 반면, 아데닐 사이클라제(Cyr1)와 같은 다른 조절자는 시험관 내와 비교하여 생체 내에서 상당히 다른 표현형을 갖는다는 것을 보여줍니다.
Introduction
칸디다 알비칸스는 점막 피부 질환, 파종성 질환 및 국소 조직 감염을 일으키는 일반적인 인간 곰팡이 병원체입니다1. C. albicans의 주요 특징은 복잡한 다형성 성장이며, 이는 공생 및 병원체 2,3,4로서의 역할과 관련이 있습니다. 30°C에서 시험관내 풍부한 영양 조건 하에서, 전형적으로 난형 출아 효모로서 성장한다. 영양소 결핍, pH 변화, 37°C에서의 성장, 혈청 노출 및 한천에 매립될 때의 성장을 포함한 다양한 환경 유발 요인은 분극화된 성장 패턴으로 전환하여 진정한 균사 및/또는 가성 균사5의 형성을 초래합니다. 분극화 된 성장의 시작과 그에 따른 사상 유기체의 성장을 형태 형성이라고합니다.
유기체의 독성에서 형태 형성의 중요성 때문에 균사 형성의 조절이 광범위하게 연구되었습니다 6,7. 형태 형성을 유발하는 신호 전달 경로와 전사 조절의 복잡한 네트워크가 있습니다. C. albicans의 형태 형성과 병인의 관계에도 불구하고, 형태 형성을 조사하는 대부분의 연구는 균사 형성을 유발하기 위해 시험관 내 자극을 사용했습니다. 필라멘트의 다양한 시험관 내 모델이 자극 된 개별 조절 경로의 관점에서 동일하지 않다는 것이 점점 더 분명 해지고 있습니다. 또한, 시험관 내 성장 조건은 숙주의 복잡한 환경과 밀접하게 일치하지 않습니다. 인간 병원체로서 C. albicans의 중요성을 감안할 때, 이 프로토콜의 목표는 중간 처리량의 시스템을 사용하여 포유류 숙주에서 활성 감염 중 형태 형성을 조사하여 조사자가 C. albicans의 돌연변이 라이브러리를 스크리닝할 수 있도록 하는 것입니다.
이러한 조사를 용이하게하기 위해 도 립 컨 포칼 현미경 8,9,10을 사용하여 마취 된 마우스의 귓바퀴에 감염되는 동안 C. albicans 세포의 높은 공간 해상도 이미지를 얻을 수있는 생체 내 이미징 시스템이 개발되었습니다. 귓바퀴의 피부는 매우 얇기 때문에 조직 해부 없이 이러한 이미지를 얻을 수 있습니다. 따라서, 정량적 표현형 데이터는 숙주 조직 내의 활성 감염 부위에서 측정될 수 있다. 여기에 설명된 프로토콜은 기준 균주 및 하나 이상의 돌연변이 균주를 상이한 형광 단백질 발현 카세트(11,12)로 형질전환시키는 것을 포함한다. 형광 단백질 발현 균주는 혼합되고 피내 동시 주사됩니다. 감염이 확립 된 후, 컨 포칼 이미징은 필라멘트의 빈도와 형성된 필라멘트의 길이를 정량화하는 데 사용됩니다. 돌연변이 균주로부터 수득된 데이터는 동일한 조직 영역에 존재하는 기준 균주로부터 수득된 것으로 정규화되어, 내부 대조군을 제공한다. 이 시스템을 통해 우리는 여러 일련의 C. albicans 돌연변이 균주를 성공적으로 스크리닝 할 수 있었으며, 그 중 다수는 시험관 내 9,10에서 형태 형성 결함을 가지고 있습니다. 이러한 균주의 대부분은 생체 내에서 쉽게 필라멘트되며, 형태 형성 조사를 위한 생체 내 모델의 중요성을 강조합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 모델은 컨포칼 현미경을 사용하여 포유류 숙주의 조직 내에서 성장하는 C. albicans 유기체의 이미지를 얻음으로써 활성 감염 동안 형태 형성 표현형을 평가할 수 있습니다. 형태 형성 과정은 C. albicans의 발병 기전의 중심이며 다양한 시험관 내 분석 2,3,4를 사용하여 널리 연구되었습니다. 그러나, 시험관내 분석은 숙주의 복잡한 생화학적 및 구조적 환경을 완전히 모델링할 수 없다.
여기에 설명된 프로토콜은 감염 중 형태형성에 관여하는 유전자를 확인하기 위해 C. albicans 돌연변이체의 시리즈/라이브러리를 스크리닝하기 위해 이 생체 내 이미징 시스템의 사용에 중점을 둡니다. 다른 형광 단백질을 발현하는 C. albicans 균주를 사용하면 기준 균주와 비교하여 C. albicans 돌연변이 균주의 생체 내 형태 형성을 정량화 할 수 있습니다. 돌연변이의 형태 형성을 동일한 감염 영역 내의 기준 균주와 비교하면 유기체가 동일한 환경에 노출됩니다. 이를 통해 필라멘테이션을 받는 세포의 비율과 필라멘테이션 정도를 정량적으로 측정할 수 있습니다. 돌연변이 균주의 측정값을 기준 균주의 측정값으로 정규화하면 한 돌연변이의 성능을 다른 돌연변이와 더 잘 비교할 수 있습니다.
여기에 제시된 대표적인 결과는 시험관 내 표현형과 생체 내 표현형 사이에 상당한 불일치의 가능성을 보여줍니다. C. albicans efg1ΔΔ 돌연변이 균주는 거의 모든 시험관 내 조건20에서 필라멘트에 실패하기 때문에 형태 형성 분석을위한 음성 대조군으로 자주 사용됩니다. 생체 내 결과는 시험관 내 결과와 매우 유사했지만,이 심하게 방해받은 균주조차도 때때로 숙주 조직 환경에서 필라멘트를 형성했습니다 (그림 3). 이것은 형태 형성을 유발하는 숙주 환경의 강도를 강조합니다.
대조적으로, cyr1ΔΔ 돌연변이체 균주는 시험관내 및 생체내 성장 사이에 실질적인 불일치를 입증하고; 돌연변이 세포 중 어느 것도 시험관 내에서 필라멘트를 거치지 않지만 세포의 약 절반은 생체 내에서 필라멘트로 성장합니다(그림 4)10,21. 흥미롭게도, 이들 필라멘트는 기준 균주에 의해 형성된 필라멘트보다 상당히 짧았으며, 이는 CYR1이 필라멘트 성장 속도 또는 필라멘트 표현형을 유지하는 능력에 기여한다는 것을 시사한다. 필라멘트 길이의 분석을 용이하게하기 위해, 필라멘트의 곡선 경로 길이는 이미지의 2 차원 투영을 사용하여 측정되었다. 3차원으로 성장하는 필라멘트의 2차원 투영에서 xy 평면과 평행하지 않은 축에서 성장하는 모든 필라멘트는 실제 길이보다 짧게 투영됩니다. 이러한 단축법은 기준 균주에 대해서도 발생하므로 2차원 투영에서 필라멘트 길이의 분포를 평가하면 기준 균주와 돌연변이 균주 간의 정량적 비교가 가능합니다. 필라멘트 길이를 3 차원이 아닌 2 차원으로 분석하려면 덜 집중적 인 이미지 분석이 필요합니다. 따라서 일반적인 데스크톱 컴퓨터에서 비교적 빠르게 수행할 수 있습니다. 이 간단한 분석을 사용하면 스크리닝 프로토콜의 일부로 필라멘트 길이 분포를 포함할 수 있으므로 처리량에 상당한 지연을 일으키지 않고 형태 형성을 겪을 수 있는 각 돌연변이의 능력에 대한 보다 미묘한 이해를 제공할 수 있습니다.
여기에 제시된 대표적인 연구는 보체 시스템에 결함이 있는 DBA2/N 마우스를 사용하여 수행되었으며, 이로 인해 C. albicans 감염 부위에 호중구를 모집하는 데 실패했습니다.22. 이 연구의 목표는 숙주 조직 내에서 C. albicans 필라멘트 조절 메커니즘을 조사하는 것이 었습니다. 따라서 DBA2/N 마우스는 개별 균주의 감수성 또는 호중구에 대한 저항성 때문에 결과를 혼동하지 않도록 사용했습니다. 호중구 항-C. 알비칸스 반응이 필라멘테이션23에 영향을 미칠 수 있기 때문에, 감염 부위로의 호중구 모집은 형태형성 분석의 결과에 영향을 미칠 수 있다. 균주가 생체 내에서 필라멘팅이 가능하지만 호중구가 존재할 때 필라멘트가 강하게 억제되는 경우 DBA2/N 마우스에서 필라멘트가 감지되지만 손상되지 않은 호중구 화학주성을 가진 마우스를 사용할 때는 나타나지 않을 것입니다. 따라서, 숙주로 사용되는 마우스의 변형은 이 프로토콜을 사용할 때 중요한 요소이다.
efg1ΔΔ 돌연변이 균주가 생체 내에서 필라멘트에 실패한다는 관찰은 숙주 호중구 반응과 관련이 없을 것인데, 이는 이 균주가 또한 시험관 내에서 필라멘트에 실패하기 때문이다. cyr1ΔΔ 균주와 함께 생체 내에서 관찰된 필라멘션은 시험관 내 필라멘테이션 실패와 불일치합니다. C. albicans의 제브라 피쉬 모델의 데이터는 반응하는 호중구가 형태 형성24의 예방에 중요하다는 것을 나타냅니다. 따라서, 호중구 반응이 없는 DBA2/N 마우스의 사용은 시험관내와 비교하여 생체내에서 cyr1ΔΔ의 필라멘테이션 증가를 설명할 가능성이 낮다. 그럼에도 불구하고, 생체내 환경은 cyr1ΔΔ 균주의 형태형성에 명백히 영향을 미치고; 따라서이 균주에 대한 추가 조사는 활성 감염 동안 C. albicans의 형태 형성 조절에 대한 중요한 정보를 제공 할 수 있습니다. 여기에 설명된 프로토콜은 향후 연구에 사용될 cyr1ΔΔ 균주와 같은 균주를 식별하기 위한 스크리닝 분석으로 설계되었습니다.
저유량 가스 마취 시스템의 사용은 이 프로토콜에 매우 유용합니다(그림 1A,B). 이 프로토콜의 초기 개발 동안, 마우스는 자일라진과 혼합 된 케타민의 주사 가능한 마취 칵테일을 사용하여 마취되었다. 이러한 마취 방법으로 제한된 영상을 수행할 수 있었지만 마취 기간을 예측할 수 없었기 때문에 영상화 중 마우스가 마취에서 회복되는 것을 방지하기 위해 영상 세션을 신속하게 종료해야 했습니다. 전통적인 흡입 마취 시스템은 부피가 크고 마취 가스의 높은 흐름 속도가 필요하며 종종 흄 후드 내에서 사용해야합니다. 따라서 기존의 흡입 마취 시스템은 조사자가 실수로 마취제에 노출되지 않고는 컨포칼 현미경의 공간 제약으로 사용하기가 매우 어렵습니다. 저 유량 흡입 마취 시스템을 사용하면 조사자에게 안전한 환경을 유지하면서 동물을 지속적으로 마취 할 수 있습니다. 저유량 노즈콘을 사용하면 접종과 현미경 검사를 위해 동물을 쉽게 배치할 수 있습니다. 소구경, 소량 전달 튜브는 비교적 긴 튜브를 사용할 수 있어 현미경 검사를 방해하지 않도록 마취 기계를 충분한 거리에 배치할 수 있습니다.
전형적인 마우스 차우에 존재하는 엽록소는 상당한 조직 자가형광을 유도한다(25). 이로 인해 이미지에 상당한 노이즈가 발생하여 고품질의 높은 공간 해상도 이미지를 얻기가 어렵습니다. 동물에게 이미징 전 7일 동안 엽록소가 없는 차우를 먹였을 때, 자가형광으로 인한 배경은 조직에서 실질적으로 감소했지만 모발에 침착된 엽록소는 계속해서 문제가 되었습니다. 처방전 없이 살 수 있는 화학 제모 크림을 사용하여 귓바퀴의 모발을 제거하면 모발의 자가형광을 최소화하는 데 효과적입니다(그림 1C,D). 따라서, 엽록소가 없는 차우와 적절한 제모의 조합은 자가형광을 실질적으로 감소시키고 이미지 품질을 극적으로 개선시켰다. 이미징 전에 머리카락이 귀에서 제거되기 때문에 동물의 머리카락 색깔은이 시스템에 영향을 미치지 않습니다. 이 프로토콜은 BALB / c (흰색), C57BL / 6 (검은 색) 및 DBA2 / N (갈색) 마우스에서 C. albicans의 감염을 연구하는 데 성공적으로 사용되었습니다. 이 프로토콜은 다양한 숙주 유전자가 결핍된 C57BL/6 녹아웃 마우스에도 사용할 수 있습니다. 이를 통해 포유류 숙주 면역 체계가 필라멘트에 어떻게 영향을 미치는지에 대한 향후 조사가 가능합니다. 이 프로토콜에서 논의되지 않은이 모델의 한 가지 특징은이 이미징 시스템이 비 침습적이기 때문에 동일한 동물을 며칠에 걸쳐 반복적으로 이미징 할 수 있으므로 시간이 지남에 따라 개별 감염의 진행 상황을 추적 할 수 있다는 것입니다. 이 기능은 숙주-병원체 상호 작용에 대한 향후 연구에서 중요한 역할을 할 것입니다.
요약하면, 이 프로토콜은 살아있는 포유류 숙주의 조직에서 자라는 C. albicans의 고공간 해상도 이미지를 생성하여 돌연변이 균주 8,9,10에서 형태 형성을 정확하게 평가할 수 있습니다. 여기에 제시된 결과는 이 프로토콜이 C. albicans 돌연변이체 라이브러리를 스크리닝하는 데 어떻게 사용될 수 있는지 보여줍니다. 현재까지 시험된 C. albicans의 돌연변이체 중, 시험관 내에서 형태형성에 공지된 결함이 있는 돌연변이체의 상당 부분이 생체내필라멘테이션을 쉽게 겪는다 9,10. 이것은 C. albicans의 발병 기전의 메커니즘을 밝히기 위해 고안된 실험에서 이와 같은 생체 내 시스템을 포함하는 것의 중요성을 강조합니다.
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 NIH 보조금 1R01AI33409와 아이오와 대학교 카버 의과 대학 소아과에서 지원했습니다.
Materials
| #1.5 coverslips | Thermo-Fisher | 20811 | large enough to cover the universal stage opening |
| 0.1 mL Insulin syringes | EXELint | 26018 | Can use syringes that are 5/16"–1/2" long and 29–32 G |
| 3.7% formaldehyde in dPBS | Sigma-Aldrich | SHBJ5734 | |
| 70% Ethanol/30% water | Decon Laboratories | A05061001A | |
| Alcohol prep pads | Covidien | 5110 | Alternative: gauze pads soaked in 70% isopropyl alcohol |
| C.albicans reference strain and experimental strains | SN250 | FGSC Online Catalog | The specific C. albicans strain varies with experiment and the investigators goals. We have used strains derived from SC5314 as well as other clinical isolates. |
| Chlorophyl free mouse chow | Envigo | 2920x | |
| Computer | Dell | Optiplex 7050 | Computer that can run imaging software for acquisition and for analysis of images. A variety of imaging software is available and varies with the specific microscope and user system. |
| Cotton tip applicator | Pro Advantage | 76200 | |
| DBA2/N (6-12 week old mice) | BALB/c and C57/BL6 mice can also be used. The latter allow for the use of widely available knockout mouse models as well as mouse models in which individual cell types, such as phagocytes, are identified by their expression of fluorescent proteins. | ||
| Double sided tape designed to hold fabric to skin (fashion tape) | local pharmacy or grocery store | Double sided adhesive tape designed for keeping clothing in place over human skin. This is typically available over the counter in pharmacies and variety stores. It is important to use this type of tape as it is designed for gentle adherence to skin. Examples: https://www.amazon.com/Womens-Fashion-Clothing-Transparent-Suitable/dp/B08S3TWR3H/ref=sr_1_40?crid=2UWFL8FMFAKGM&keywords =fashion+tape&qid=1649174406&sprefix= fashion+tape%2Caps%2C70&sr=8-40 https://www.amazon.com/Fearless-Tape-Sensitive-Clothing-Transparent/dp/B07QY8V5XT/ref=sr_1_26?crid=2UWFL8FMFAKGM&keywords =fashion+tape&qid=1649174320&sprefix= fashion+tape%2Caps%2C70&sr=8-26 https://www.amazon.com/Hollywood-Fashion-Secrets-Tape-Floral/dp/B009RX77MK/ref=sr_1_29?crid=2UWFL8FMFAKGM&keywords =fashion+tape&qid=1649174406&sprefix= fashion+tape%2Caps%2C70&sr=8-29 |
|
| Dulbecco's phosphate buffered saline | Gibco / Thermo-Fisher | 14190-144 | Must be sterile; open a new container for every experiment |
| Fetal bovine serum | Gibco / Thermo-Fisher | 26140-079 | |
| Gauze pad | Pro Advantage | P157112 | |
| Gel eye lurbicant | local pharmacy or grocery store | ||
| ImageJ or FIJI analysis software | NIH | ImageJ (FIJI) | |
| Isoflurane | Akorn | J119005 | |
| Leica DMi8 (SP8 platform) with Leica 11506375 objective lens | Leica | DMi8 (SP8) | The objective lens (Leica 11506375) used here is a 25x water immersion lens to allow us to have a high NA (0.95) while approximating the refractive index of the ear tissue. The microscope (Leica DMi8 (SP8 platform) has 488 nm and 638 nm diode laser lines and is equipped with filter-free spectral detection with computer controlled adjustable bandwidth for detection of emission light. The stage must have enough clearance to allow the objective to reach the bottom coverslip without hitting the stage. |
| Low-flow anesthesia system or traditional anesthesia vaporizer | Kent Scientific International | SomnoSuite | |
| Nair hair remover lotion | local pharmacy or grocery store | Over the counter depilatory cream | |
| Nourseothricin | Jena Bioscience | AB-101L | |
| pENO1-NEON-NATR pENO1-iRFP-NATR plasmids | Fluorescent protein expression transformation constructs generously given to us by Dr. Robert Wheeler (Seman, et al., 2018, Infection and Immunity; Bergeron, et al., 2017, Infection and Immunity) | ||
| Pressure sensitive laboratory tape | Tape & Label Graphic Systems Inc | 1007910 | |
| RPMI1640 cell culture medium | Gibco / Thermo-Fisher | 11875-093 | |
| Thimble, plastic 15 mL conical tube, or Falcon 5 mL round bottom polystyrene tubes | Falcon | 352196 | To safely hold the animals ear during injectinos |
Referanslar
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