Visualización de la dinámica conformacional de los receptores de membrana utilizando FRET de molécula única

La transferencia de información a través de la membrana plasmática depende en gran medida de la función de los receptores de membrana¹. La unión del ligando a un receptor conduce a un cambio conformacional y a la activación del receptor. Este proceso es a menudo alostérico en la naturaleza². Con más de 800 miembros, los receptores acoplados a proteínas G (GPCR) son la familia más grande de receptores de membrana en humanos³. Debido a su papel en casi todos los procesos celulares, los GPCR se han convertido en objetivos importantes para el desarrollo terapéutico. En el modelo canónico de señalización GPCR, la activación de agonistas da lugar a cambios conformacionales del receptor que posteriormente activan el complejo heterotrimérico de proteína G a través del intercambio de GDP por GTP en el bolsillo de unión a nucleótidos de G_α. Las subunidades G α-GTP y G_βγ activadas controlan entonces la actividad de las proteínas efectoras aguas abajo y propagan la cascada de señalización ^4,5. Este proceso de señalización depende esencialmente de la capacidad de los ligandos para cambiar la forma tridimensional del receptor. Una comprensión mecanicista de cómo los ligandos logran esto es fundamental para desarrollar nuevas terapias y diseñar receptores y sensores sintéticos.

Los receptores metabotrópicos de glutamato (mGluRs) son miembros de la familia GPCR de clase C y son importantes para los efectos neuromoduladores lentos del glutamato y la sintonización de la excitabilidad neuronal ^6,7. Entre todos los GPCR, los GPCR de clase C son estructuralmente únicos en el sentido de que funcionan como dímeros obligados. mGluRs contiene tres dominios estructurales: el dominio Venus atrapamoscas (VFT), el dominio rico en cisteína (CRD) y el dominio transmembrana (TMD)⁸. Los cambios conformacionales durante el proceso de activación son complejos e implican acoplamiento conformacional local y global que se propaga a una distancia de 12 nm, así como cooperatividad de dímeros. Se desconocen las conformaciones intermedias, el orden temporal de los estados y la tasa de transición entre estados. Al seguir la conformación de receptores individuales en tiempo real, es posible identificar los estados intermedios transitorios y la secuencia de cambios conformacionales durante la activación. Esto se puede lograr aplicando una sola molécula de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia ^9,10 (smFRET), como se aplicó recientemente para visualizar la propagación de cambios conformacionales durante la activación de mGluR2 ¹¹. Un paso clave en los experimentos FRET es la generación de sensores FRET mediante la inserción específica del sitio de los fluoróforos donantes y aceptores en la proteína de interés. Se adoptó una estrategia de incorporación de aminoácidos no naturales (UAA)^12,13,14,15 para superar las limitaciones de las tecnologías típicas de etiquetado fluorescente específicas del sitio que requieren la creación de mutantes sin cisteína o la inserción de una gran etiqueta codificada genéticamente. Esto permitió observar el reordenamiento conformacional del enlazador alostérico compacto esencial, que se unió a los dominios de unión al ligando y señalización de mGluR2. En este protocolo, se presenta una guía paso a paso para realizar experimentos smFRET en mGluR2, incluido el enfoque para el etiquetado específico del sitio de mGluR2 con UAA para unir fluoróforos utilizando la reacción de ciclación de azida catalizada por cobre. Además, este protocolo describe la metodología para la captura directa de proteínas de membrana y el análisis de datos. El protocolo descrito aquí también es aplicable al estudio de la dinámica conformacional de otras proteínas de membrana.