Visualizando a dinâmica conformacional de receptores de membrana usando FRET de molécula única

A transferência de informações através da membrana plasmática é fortemente dependente da função dos receptores de membrana¹. A ligação do ligante a um receptor leva a uma alteração conformacional e à ativação do receptor. Este processo é muitas vezes alostérico na natureza². Com mais de 800 membros, os receptores acoplados à proteína G (GPCRs) são a maior família de receptores de membrana em humanos³. Devido ao seu papel em quase todos os processos celulares, os GPCRs tornaram-se alvos importantes para o desenvolvimento terapêutico. No modelo canônico de sinalização GPCR, a ativação do agonista resulta em alterações conformacionais do receptor que subsequentemente ativam o complexo proteico G heterotrimérico via troca de PIB por GTP na bolsa de ligação de nucleotídeos de G_α. As subunidades G α-GTP e G_βγ ativadas controlam a atividade das proteínas efetoras a jusante e propagam a cascata de sinalização ^4,5. Este processo de sinalização depende essencialmente da capacidade dos ligantes de alterar a forma tridimensional do receptor. Uma compreensão mecanicista de como os ligantes conseguem isso é fundamental para o desenvolvimento de novas terapêuticas e o design de receptores e sensores sintéticos.

Os receptores metabotrópicos de glutamato (mGluRs) são membros da família GPCR classe C e são importantes para os efeitos neuromoduladores lentos do glutamato e para a excitabilidade neuronal de sintonia ^6,7. Entre todos os GPCRs, os GPCRs de classe C são estruturalmente únicos, pois funcionam como dímeros obrigatórios. Os mGluRs contêm três domínios estruturais: o domínio da armadilha de Vênus (VFT), o domínio rico em cisteína (CRD) e o domínio transmembrana (TMD)⁸. As mudanças conformacionais durante o processo de ativação são complexas e envolvem acoplamento conformacional local e global que se propagam a uma distância de 12 nm, bem como a cooperatividade do dímero. As conformações intermediárias, a ordenação temporal dos estados e a taxa de transição entre os estados são desconhecidas. Seguindo a conformação de receptores individuais em tempo real, é possível identificar os estados intermediários transitórios e a sequência de alterações conformacionais durante a ativação. Isso pode ser conseguido por meio da aplicação de transferência de energia de ressonância de fluorescência de molécula única ^9,10 (smFRET), como foi recentemente aplicado para visualizar a propagação de alterações conformacionais durante a ativação do mGluR2 ¹¹. Um passo fundamental nos experimentos FRET é a geração de sensores FRET pela inserção site-specific dos fluoróforos doador e aceitador na proteína de interesse. Uma estratégia de incorporação de aminoácidos não naturais (AIA) foi adotada ^12,13,14,15 para superar as limitações das tecnologias típicas de marcação fluorescente site-specific que exigem a criação de mutantes sem cisteína ou a inserção de uma grande etiqueta geneticamente codificada. Isso permitiu observar o rearranjo conformacional do essencial ligador alostérico compacto, que uniu os domínios de ligação e sinalização do ligante do mGluR2. Neste protocolo, um guia passo-a-passo para a realização de experimentos smFRET em mGluR2 é apresentado, incluindo a abordagem para marcação site-specific de mGluR2 com UAA para anexar fluoróforos usando a reação de ciclização azida catalisada por cobre. Além disso, este protocolo descreve a metodologia para a captura direta de proteínas de membrana e análise de dados. O protocolo descrito aqui também é aplicável ao estudo da dinâmica conformacional de outras proteínas de membrana.