단일 분자 FRET를 사용한 막 수용체의 구조적 역학 시각화
Özet
이 연구는 비천연 아미노산(UAA) 통합을 통한 부위 특이적 표지를 사용하여 G 단백질 결합 수용체(GPCR)에 대한 단일 분자 형광 공명 에너지 전달(smFRET) 실험을 수행하는 자세한 절차를 제시합니다. 이 프로토콜은 smFRET 샘플 준비, 실험 및 데이터 분석을 위한 단계별 가이드를 제공합니다.
Abstract
외부 신호에 반응하는 세포의 능력은 세포 발달, 성장 및 생존에 필수적입니다. 환경의 신호에 응답하려면 세포가이를 인식하고 처리 할 수 있어야합니다. 이 작업은 주로 신호를 세포의 생화학 적 언어로 변환하는 역할을하는 막 수용체의 기능에 의존합니다. G 단백질 결합 수용체 (GPCR)는 인간에서 가장 큰 막 수용체 단백질 계열을 구성합니다. GPCR 중에서 대사성 글루타메이트 수용체 (mGluRs)는 절대 이량 체로 기능하고 리간드 결합 부위를 포함하는 큰 세포 외 도메인을 보유하는 고유 한 하위 클래스입니다. mGluR의 구조 연구의 최근 발전은 활성화 과정에 대한 이해를 향상 시켰습니다. 그러나 활성화 및 변조 중에 mGluR을 통한 대규모 구조적 변화의 전파는 제대로 이해되지 않습니다. 단일 분자 형광 공명 에너지 전달(smFRET)은 단일 단백질 수준에서 생체 분자의 구조 역학을 시각화하고 정량화하는 강력한 기술입니다. mGluR2 활성화의 동적 과정을 시각화하기 위해 비천연 아미노산(UAA) 통합을 기반으로 하는 형광 입체 추적 센서가 개발되어 수용체의 고유 구조를 교란하지 않고 부위 특이적 단백질 표지를 수행할 수 있습니다. 여기에 설명된 프로토콜은 새로운 UAA 라벨링 접근법, 샘플 준비, smFRET 데이터 수집 및 분석을 포함하여 이러한 실험을 수행하는 방법을 설명합니다. 이러한 전략은 일반화 가능하며 다양한 막 단백질의 구조적 역학을 조사하기 위해 확장 될 수 있습니다.
Introduction
원형질막을 통한 정보의 전달은 막 수용체1의 기능에 크게 의존합니다. 수용체에 대한 리간드 결합은 구조적 변화 및 수용체 활성화를 유도한다. 이 과정은 종종 자연에서 알로 스테 릭입니다2. 800명 이상의 구성원을 보유한 G 단백질 결합 수용체(GPCR)는 인간에서 가장 큰 막 수용체 계열입니다3. 거의 모든 세포 과정에서의 역할로 인해 GPCR은 치료 개발의 중요한 표적이되었습니다. GPCR 신호전달의 표준 모델에서, 작용제 활성화는 G α의 뉴클레오티드 결합 포켓에서 GDP를 GTP로 교환함으로써 이종 삼량 체 G 단백질 복합체를 활성화시키는 수용체의 구조적 변화를 초래한다. 활성화 된 Gα-GTP 및 Gβγ 서브 유닛은 다운 스트림 이펙터 단백질의 활성을 제어하고 신호 전달 캐스케이드 4,5를 전파합니다. 이 신호 전달 과정은 본질적으로 수용체의 3 차원 모양을 변경하는 리간드의 능력에 의존합니다. 리간드가 이를 달성하는 방법에 대한 기계론적 이해는 새로운 치료제를 개발하고 합성 수용체 및 센서를 설계하는 데 중요합니다.
대사성 글루타메이트 수용체 (mGluRs)는 클래스 C GPCR 계열의 구성원이며 글루타메이트의 느린 신경 조절 효과 및 신경 흥분성 튜닝에 중요합니다 6,7. 모든 GPCR 중에서 클래스 C GPCR은 절대 이량체로 기능한다는 점에서 구조적으로 독특합니다. mGluR은 금성 파리 통 (VFT) 도메인, 시스테인이 풍부한 도메인 (CRD) 및 막 횡단 도메인 (TMD)의 세 가지 구조 도메인을 포함합니다 8. 활성화 과정 동안의 구조적 변화는 복잡하며 12nm 거리에 걸쳐 전파되는 국소 및 글로벌 구조적 결합과 이량체 협력성을 포함합니다. 중간 형태, 상태의 시간적 순서 및 상태 간의 전환 속도는 알려져 있지 않습니다. 개별 수용체의 형태를 실시간으로 추적함으로써 일시적인 중간 상태와 활성화 중 구조적 변화의 순서를 식별 할 수 있습니다. 이는 mGluR2 11의 활성화 동안 구조적 변화의 전파를 시각화하기 위해 최근에 적용된 것처럼 단일 분자 형광 공명 에너지 전달 9,10(smFRET)을 적용하여 달성할 수 있습니다. FRET 실험의 핵심 단계는 공여체 및 수용체 형광단을 관심 단백질에 부위 특이적으로 삽입하여 FRET 센서를 생성하는 것입니다. 비천연 아미노산(UAA) 혼입 전략이 채택되었습니다 12,13,14,15 시스테인이 없는 돌연변이를 생성하거나 유전적으로 암호화된 큰 태그를 삽입해야 하는 일반적인 부위 특이적 형광 표지 기술의 한계를 극복하기 위해. 이를 통해 mGluR2의 리간드 결합 및 신호 전달 도메인에 합류하는 필수 콤팩트 알로스테릭 링커의 구조적 재배열을 관찰할 수 있었습니다. 이 프로토콜에서는 구리 촉매 아지드 고리화 반응을 사용하여 형광단을 부착하기 위해 UAA로 mGluR2의 부위별 라벨링에 대한 접근 방식을 포함하여 mGluR2에 대한 smFRET 실험을 수행하기 위한 단계별 가이드가 제시됩니다. 또한, 이 프로토콜은 막 단백질의 직접 포획 및 데이터 분석을 위한 방법론을 설명합니다. 여기에 설명 된 프로토콜은 다른 막 단백질의 구조적 역학을 연구하는 데에도 적용 할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
GPCR은 신호 전달을 시작하기 위해 세포막에서 작동하는 단백질입니다. 많은 GPCR은 여러 도메인으로 구성되며 신호는 도메인 간의 협력 상호 작용에 의존합니다. 이러한 막 수용체의 특성을 조절하려면 여러 도메인의 동적 거동을 이해하는 것이 필수적입니다. 단일 분자 형광 공명 에너지 전달(smFRET)은 단백질 형태 및 역학을 실시간으로 측정할 수 있는 형광 기술입니다(11,32</…
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
토론을 위해 Reza Vafabakhsh 연구소 회원들에게 감사드립니다. 이 작업은 국립 보건원 보조금 R01GM140272 (RV), 노스 웨스턴 대학의 생명 과학을위한 Searle 리더십 기금 및 시카고 커뮤니티 트러스트의 Searle Funds의 지원을 받아 시카고 생물 의학 컨소시엄 (RV). BWL은 국립 일반 의학 연구소 (NIGMS) 교육 보조금 T32GM-008061의 지원을 받았습니다.
Materials
| (+)-Sodium L-Ascorbate | Sigma Aldrich | Cat # 11140-250G | |
| 4-azido-L-phenylalanine | Chem-Impex International | Cat # 06162 | |
| 548UAA | Liauw et al. 2021 | Transfected construct | |
| Acetic Acid | Fisher Chemical | 64-19-7 | |
| Acetone | Fisher Chemical | 67-64-1 | |
| Adobe Illustrator (2022) | https://www.adobe.com/ | RRID:SCR_010279 | Software, algorithm |
| Aminoguanidine (hydrochloride) | Cayman Chemical | 81530 | |
| Aminosilane | Aldrich | 919-30-2 | |
| Bath Sonicator 2.8 L | Fisher Scientific | Ultrasonic Bath 2.8 L | |
| Biotin-PEG | Laysan Bio Inc | Item# Biotin-PEG-SVA-5000-100mg | |
| BTTES | Click Chemistry Tools | 1237-500 | |
| Copper (II) sulfate | Sigma Aldrich | Cat # 451657-10G | |
| Cover slip | VWR | 16004-306 | Sample chamber |
| Cy3 Alkyne | Click Chemistry Tools | TA117-5 | |
| Cy5 Alkyne | Click Chemistry Tools | TA116-5 | |
| DDM | Anatrace | Part# D310 1 GM | Detergent |
| DDM-CHS (10:1) | Anatrace | Part# D310-CH210 1 ML | Detergent with cholecterol |
| Defined Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | SH30070.03 | |
| Di01-R405/488/561/635 | Semrock | Notch filter | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| EMCCD | Andor | DU-897U | Camera |
| ET542lp | Chroma | Long pass emission filter | |
| FF640-FDi01 | Semrock | Emission dichroic filter | |
| FLAG-tag antibody | Genscript | A01429 | |
| Fluorescent bead | Invitrogen T7279 | TetraSpeck microspheres | Spherical bead |
| Glass slides | Fisherfinest | 12-544-4 | sample chamber |
| Glutamate | Sigma Aldrich | Cat # 6106-04-3 | |
| HEK 293T | Sigma Aldrich | Cat # 12022001 | Cell line |
| HEPES | FisherBioReagents | 7365-45-9 | |
| Image splitter | OptoSplit II | ||
| KOH | Fluka | 1310-58-3 | |
| Laser | Oxxius | 4-line laser combiner | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000015 | Transfection Reagent |
| Methanol | Fisher Chemical | 67-56-1 | |
| Microscope | Olympus | Olympus IX83 | |
| Milli-Q water | Barnstead | Water Deionizer | |
| m-PEG | Laysan Bio Inc | Item# MPEG-SIL-5000-1g | |
| NF03-405/488/532/635 | Semrock | Dichroic mirror | |
| OptiMEM | Thermo Fisher Scientific | 51985091 | Reduced Serum Medium |
| OptiMEM/Reduced serum medium | Thermo Fisher Scientific | ||
| OriginPro (2020b) | https://www.originlab.com/ | RRID:SCR_014212 | Data analysis and graphing software |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| pIRE4-Azi | Addgene | Plasmid # 105829 | Transfected construct |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma Aldrich | Cat # P2636 | |
| Protocatechuic acid (PCA) | HWI group | 99-50-3 | |
| smCamera (Version 1.0) | http://ha.med.jhmi.edu/resources/ | Camera software | |
| Sodium bicarbonate | FisherBioReagents | 144-55-8 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma | 1310-73-2 | |
| Syringe filter | Whatman UNIFLO | Cat#9914-2502 | Liquid filtration |
| Trolox | Sigma | 53188-07 |
Referanslar
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