Visualizzazione della dinamica conformazionale dei recettori di membrana utilizzando FRET a singola molecola

Il trasferimento di informazioni attraverso la membrana plasmatica dipende fortemente dalla funzione dei recettori di membrana¹. Il legame del ligando a un recettore porta a un cambiamento conformazionale e all’attivazione del recettore. Questo processo è spesso di natura allosterica². Con oltre 800 membri, i recettori accoppiati a proteine G (GPCR) sono la più grande famiglia di recettori di membrana nell’uomo³. A causa del loro ruolo in quasi tutti i processi cellulari, i GPCR sono diventati obiettivi importanti per lo sviluppo terapeutico. Nel modello canonico di segnalazione GPCR, l’attivazione agonista provoca cambiamenti conformazionali del recettore che successivamente attivano il complesso della proteina G eterotrimerica attraverso lo scambio di GDP per GTP nella tasca di legame nucleotidico di G_α. Le subunità G α-GTP e G_βγ attivate controllano quindi l’attività delle proteine effettrici a valle e propagano la cascata di segnalazione ^4,5. Questo processo di segnalazione dipende essenzialmente dalla capacità dei ligandi di cambiare la forma tridimensionale del recettore. Una comprensione meccanicistica di come i ligandi raggiungono questo obiettivo è fondamentale per lo sviluppo di nuove terapie e la progettazione di recettori e sensori sintetici.

I recettori metabotropici del glutammato (mGluR) sono membri della famiglia GPCR di classe C e sono importanti per gli effetti neuromodulatori lenti del glutammato e per la sintonizzazione dell’eccitabilità neuronale ^6,7. Tra tutti i GPCR, i GPCR di classe C sono strutturalmente unici in quanto funzionano come dimeri obbligati. mGluR contiene tre domini strutturali: il dominio Venere acchiappamosche (VFT), il dominio ricco di cisteina (CRD) e il dominio transmembrana (TMD)⁸. I cambiamenti conformazionali durante il processo di attivazione sono complessi e coinvolgono l’accoppiamento conformazionale locale e globale che si propaga su una distanza di 12 nm, così come la cooperatività del dimero. Le conformazioni intermedie, l’ordinamento temporale degli stati e il tasso di transizione tra gli stati sono sconosciuti. Seguendo in tempo reale la conformazione dei singoli recettori è possibile individuare gli stati intermedi transitori e la sequenza dei cambiamenti conformazionali durante l’attivazione. Questo può essere ottenuto applicando il trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza a singola molecola ^9,10 (smFRET), come è stato recentemente applicato per visualizzare la propagazione dei cambiamenti conformazionali durante l’attivazione di mGluR2 ¹¹. Un passo fondamentale negli esperimenti FRET è la generazione di sensori FRET mediante inserimento sito-specifico dei fluorofori donatori e accettori nella proteina di interesse. Una strategia di incorporazione di aminoacidi innaturali (UAA) è stata adottata^12,13,14,15 per superare i limiti delle tipiche tecnologie di etichettatura fluorescente sito-specifiche che richiedono la creazione di mutanti senza cisteina o l’inserimento di un grande tag geneticamente codificato. Ciò ha permesso di osservare il riarrangiamento conformazionale dell’essenziale linker allosterico compatto, che si univa ai domini di legame e segnalazione del ligando di mGluR2. In questo protocollo, viene presentata una guida passo-passo per eseguire esperimenti smFRET su mGluR2, incluso l’approccio per l’etichettatura sito-specifica di mGluR2 con UAA per attaccare fluorofori utilizzando la reazione di ciclizzazione dell’azide catalizzata dal rame. Inoltre, questo protocollo descrive la metodologia per la cattura diretta delle proteine di membrana e l’analisi dei dati. Il protocollo qui delineato è applicabile anche allo studio della dinamica conformazionale di altre proteine di membrana.