使用单分子FRET可视化膜受体的构象动力学

跨质膜的信息传递在很大程度上取决于膜受体的功能¹。配体与受体结合导致构象变化和受体活化。这个过程在本质上通常是变构的².G蛋白偶联受体（GPCR）拥有800多个成员，是人类最大的膜受体家族³。由于其在几乎所有细胞过程中的作用，GPCR已成为治疗开发的重要靶标。在GPCR信号传导的典型模型中，激动剂激活导致受体的构象变化，随后通过在G_α的核苷酸结合口袋中将GDP交换为GTP来激活异源三聚体G蛋白复合物。活化的G_α-GTP和G_βγ亚基然后控制下游效应蛋白的活性并传播信号级联^4，5。这种信号传导过程基本上取决于配体改变受体三维形状的能力。对配体如何实现这一目标的机制理解对于开发新疗法和设计合成受体和传感器至关重要。

代谢性谷氨酸受体（mGluRs）是C类GPCR家族的成员，对于谷氨酸的缓慢神经调节作用和调节神经元^{兴奋性很重要}6^，7。在所有GPCR中，C类GPCR在结构上是独一无二的，因为它们作为专性二聚体起作用。mGluR包含三个结构域：金星捕蝇器（VFT）结构域，富含半胱氨酸的结构域（CRD）和跨膜结构域（TMD）⁸。活化过程中的构象变化是复杂的，涉及在12 nm距离上传播的局部和全局构象耦合，以及二聚体的协同性。中间构象、状态的时间顺序和状态之间的转换速率是未知的。通过实时跟踪单个受体的构象，可以识别瞬时中间状态和激活过程中构象变化的序列。这可以通过应用单分子荧光共振能量转移⁹，¹⁰（smFRET）来实现^，就像最近应用于可视化mGluR2¹¹活化过程中构象变化的传播一样。FRET实验的一个关键步骤是通过将供体和受体荧光团插入目标蛋白质的位点特异性插入来生成FRET传感器。采用非天然氨基酸（UAA）掺入策略12，^13，14，¹⁵，^以克服典型的位点特异性荧光标记技术的局限性^，该技术需要创建无半胱氨酸突变体或插入大型基因编码标签。这允许观察到基本的致密变构接头的构象重排，该接头连接了mGluR2的配体结合和信号结构域。在该协议中，提供了在mGluR2上进行smFRET实验的分步指南，包括使用UAA对mGluR2进行位点特异性标记以使用铜催化叠氮化物环化反应附着荧光团的方法。此外，该协议描述了直接捕获膜蛋白和数据分析的方法。此处概述的方案也适用于研究其他膜蛋白的构象动力学。