我们开发了一种双光子全息显微镜,可以使用高时空分辨率可视化、评估和操纵神经活动,目的是阐明与异常神经活动相关的神经精神疾病的发病机制。
光学生物成像和光遗传学的最新进展使得能够可视化和操纵活体动物的生物现象,包括细胞活动。在神经科学领域,现在已经揭示了与大脑功能相关的详细神经活动,例如学习和记忆,并且人为地操纵这种活动来表达大脑功能已经变得可行。然而,通过双光子Ca2+ 成像对神经活动的常规评估存在时间分辨率低的问题。此外,常规光遗传学通过光纤操纵神经活动只能同时调节具有相同遗传背景的神经元的活动,难以控制单个神经元的活动。为了解决这个问题,我们最近开发了一种具有高时空分辨率的显微镜,通过将光遗传学与可以修改飞秒红外激光束的数字全息技术相结合,用于生物应用。在这里,我们描述了用于可视化,评估和操作神经活动的协议,包括样品的制备和双光子全息显微镜的操作(图1)。这些协议提供了关于神经活动的准确时空信息,这可能有助于阐明导致神经活动异常的神经精神疾病的发病机制。
双光子Ca2+成像是评估神经活动的有用技术。它不仅可以用于识别正常动物的行为和记忆所需的神经活动1,2,还可以用于识别神经精神疾病小鼠模型中发生的异常神经元活动3,4。该技术已被用于阐明大脑功能的神经基础。然而,尽管它可以提供高分辨率和高质量的图像,但其时间分辨率低于电生理方法1,3。
光遗传学有助于创新神经科学家理解大脑功能的方式5。鉴于技术限制,大多数光遗传学研究都使用了低空间分辨率的激活方案,从而限制了可以相应地执行的神经活动操作类型。然而,在更精细的时空尺度上操纵神经活动可能有助于更全面地理解神经计算和神经精神疾病的发病机制。可以塑造飞秒近红外激光束的空间精确全息技术有望克服这一挑战,并开辟了以前不可能的几个新的实验类别6,7。这项技术使神经科学家能够揭示遥不可及的感觉、认知和行为神经代码的基本方面和病理学。
全息投影涉及生成所需的光模式,以选择性地访问单个细胞和功能网络。体内实验需要将光最佳地传递到活体大脑中的靶细胞。红外光深入活组织,可用于非线性双光子激发(2PE)8,9,10。因此,结合全息投影和2PE的双光子全息显微镜可用于评估和操纵神经活动以探测体内的细胞和功能网络。双光子全息显微镜的最新生物学应用阐明了视觉皮层11,12,嗅球13和海马体14中学习所需的神经活动和回路。
全球许多实验室都报告了使用其全息刺激系统15,16,17,18,19,20,21,22,23的令人兴奋的结果和改进。在这里描述的系统中,全息刺激系统可以构建为传统显微镜的附加设备。仅相位空间光调制器(SLM)是将平面波前调制为任何形状的关键器件,干涉效应用于控制焦点的强度和位置。图2显示了全息刺激和成像光路。第一条光路用于点扫描成像模式,由扫描头和图像探测器组成。第二条光路用于波长为 1040 nm 的全息刺激,由 SLM1 组成。第三条光路用于波长为920 nm的全息照明,由SLM2和图像传感器组成。全息成像模式可以通过照亮样品中的多个点来记录来自多个感兴趣区域的强度。这样,录制速度可以提高到每秒几百帧。为了实现点扫描成像或全息照明成像,920 nm激光器通过固定比例为3:7的分束器分成两条路径。所有光学元件都对准在尺寸为 600 mm × 600 mm 的光学试验板上。调制后的光通过显微体侧面的光口进入,而点扫描成像光通过显微体顶部的扫描头进入。这些光集成在物镜正上方,并在样品平面中形成焦点。此外,定制软件使常规工作流程变得简单和一致。
在本文中,提出了一个完整的协议,用于使用全息刺激或照明来测量神经活动并评估神经元之间的功能连接。为了演示目的,我们在这里描述了一种针对小鼠大脑初级躯体感觉皮层(S1HL)后肢区域的脑部手术,以及一种使用双光子全息显微镜评估和操纵神经活动的方法。实验程序分为四个部分。首先,使用牙科水泥将头板固定在小鼠的头骨上。其次,将表达jGCaMP8f或GCaMP6m-P2A-ChRmine的病毒载体立体定向注射到S1HL中。第三,校准全息刺激或照明系统。第四,在这两种蛋白质术后恢复和表达后,用双光子全息显微镜进行 体内 Ca2+ 成像,评估神经元之间的神经活动和功能连接。
为了了解大脑功能,有必要通过提取神经活动的动力学来准确评估大脑功能背后的神经回路。此外,必须确定这种神经回路如何改变以阐明神经精神疾病的发病机制。事实上,已知在阿尔茨海默病4 和脆性X综合征26 的小鼠模型以及白质功能受损的小鼠3中神经活性升高。此外,在炎症性疼痛的小鼠模型中,神经活动和神经元之间功能连接的同步增加与症状有关24。双光子全息显微镜使我们能够同时观察单个神经元的活动和神经元之间的功能连接,这对于理解神经回路是必要的。我们使用25倍物镜,数值孔径= 1.1,波长为1,040 nm。理论点扩散函数是横向最大0.5 μm和轴向1.7 μm的全宽高斯分布。然而,实际数值孔径小于1.1,荧光珠上测得的光斑尺寸横向为1.2μm,轴向为8.3μm。鉴于神经元直径约为15μm,校准误差在3μm以内,因此靶向通常很好。然而,轴向的细胞可能会受到较长的光斑尺寸6的影响。在这里,我们描述了病毒注射,手术,全息刺激或照明系统的校准,以及使用我们的显微镜系统评估和操纵活小鼠神经活动的成像协议。
完成所有实验程序需要2-4周,从顶板植入和病毒注射到使用全息显微镜进行 体内 Ca2+ 成像的数据采集。该过程复杂而费力,实验的最终成功取决于多种因素,包括受术后炎症影响的颅窗状况,Ca2+ 指示剂和视蛋白的正确选择,以及是否可以纠正采集图像中的运动伪影。特别是,两个步骤对于成功的结果很重要。第一个涉及头板固定和手术;用牙科水泥将头板牢固地固定在鼠标头上至关重要。此外,在手术过程中使用冷ACSF反复清洁骨碎片和凝结的血液也很重要。由于坚持这一程序可以减少炎症,我们成功地观察了小胶质细胞的动力学,小胶质细胞是负责大脑免疫系统的细胞,而不会激活它们的过程和脊柱或神经元的微观结构27,28。第二个问题是神经活动的评估和操作。我们选择AAV2 / 8-CaMKII-GCaMP6m-P2A-ChRmine-Kv2.1在一个神经元中同时表达Ca2+ 指示剂和视蛋白。这是因为很难用不同的AAV类型有效地感染一个神经元。这种选择的另一个原因是ChRmine可以使用双光子激光器有效地激活1,040nm处的神经活动12。最近,据报道,ChRmine通过基于冷冻电子显微镜获得的结构信息改变其结构,改善了其功能29,这被认为可用于神经科学领域的靶功能分析。鉴于这些问题,有必要分享在使用全息显微镜读取神经活动和写入信息时评估和操纵神经元的有效方法。
成像和光遗传学的最新进展揭示了涉及大脑功能(如学习和记忆)的详细神经活动,并且可以人为地操纵这种神经活动来表达大脑功能30。然而,由于在大脑中插入光纤并且由于同时刺激一组表达视蛋白的细胞,因此操纵神经活动的常规方法是高度侵入性的,因此不可能以时间和空间精度操纵神经活动。我们的方法可以通过仅刺激大脑中的特定神经元来操纵神经活动,从而能够以特定的刺激模式和高时空分辨率操纵神经活动。此外,重要的是要注意,神经元之间的功能连接只能在少数神经元中使用脑切片实验31进行评估;然而,这种技术允许同时评估活体动物中的多个神经元。
当前全息显微镜的主要限制之一是需要固定鼠标头,这限制了鼠标的行为。最近,开发了小型化双光子显微镜32,随着该设备的进一步小型化,在自由移动的小鼠中,具有全息刺激的 体内 Ca2+ 成像成为可能。此外,通过提高成像的时间分辨率并将其与高灵敏度的电压敏感荧光蛋白相结合,可以扩大该显微镜的潜力33。
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了创新领域科学研究补助金(19H04753、19H05219和25110732给H.W.)、变革性研究领域补助金(A)(20H05899至H.W.,20H05886至O.M.和21H05587至D.K.)、促进联合国际研究(B)(20KK0170至H.W.)、科学研究补助金(B)(18H02598至H.W.)、 科学研究补助金(A)(21H04663至O.M.),早期职业科学家补助金(20K15193至X.Q.),JST徽章资助号JPMJCR1755,日本和JST A-STEP资助号JPMJTR204C。
25x Objective | Nikon | N25X-APO-MP | Objective |
A1MP | Nikon | A1MP | Microscope |
AnesII | Bio machinery | AnesII | Anesthesia delivery system |
C2 plus | Nikon | C2 plus | Microscope |
DECADRON Phosphate Injection | Aspen | 21N024 | Avoid cerebral edema |
Dental Drill | Jota | C1.HP.005 | Dental drill |
Electric Microinjector | NARISHIGE | IM-31 | Pressure injection system |
FEATHERS | FEARGER | FA-10 | Shaving |
G-CEM ONE ADHESIVE ENHANCING PRIMER | GC | 2110271 | Resin cement primer for dental adhesion |
G-CEM ONE neo | GC | 43093 | Resin cement for dental adhesion |
Glass Capillary with Filament | NARISHIGE | GDC-1 | Glass capillary |
Image Detector | Hamamatsu | H10770PA-40 | GaAsP photocathode photomultiplier tube |
Imaging Software | Nikon | NISelements | Imaging software |
Isoflurane Inhalation Solution | Pfizer | 229KAR | Anesthetics |
iXon EMCCD Camera | Andor | iXon Life 888 | Image sensor |
Ketamine | daiitisannkyou | s9-018506 | Anesthetics |
Leica-M60 | Leica | M60 | Stereoscope |
Linicon | Linicon | LV-125 | Vacuum pump |
Mode-locked Ti:sapphire Chameleon Ultra II laser | Coherent | Chameleon Discovery NX | Femtosecond laser |
Mos-Cure | U-VIX | mini 365 | Portable LED UV Light Source |
PEN Bright | SHOFU INC. | PEN Bright | Dental light curing unit |
Puller | SUTTER instaument | P-97 | Puller |
Stereotaxic Instrument (for Mice) | NARISHIGE | SR-6M-H | Stereotaxic instrument |
Stereotaxic Micromanipulator | NARISHIGE | SM-15R | Stereotaxic micromanipulator |
Super-Bond CATALYST V | SUN MEDICAL | 8070 | Dental adhesive resin cement |
Super-Bond Dental Adhesive Monomer | SUN MEDICAL | 8071 | Dental adhesive monomer |
Super-Bond Teeth Color Polymer Powder | SUN MEDICAL | 145052000 | Teeth color polymer powder |
Tarivid Ophthalmic Ointment 0.3% | Santen Pharmaceutical | TRN3952 | Eye ointment |
UlTIMATE XL | NSK | Y141446 | Dental laboratory micromotor control unit |
UV Curing Optical Adhesives | THORLABS | NOA61 | UV Curing Optical Adhesives |
Xylazine | Bayer | KP0F2BK | Anesthetics |