Исследование микробной кооперации с помощью визуализационного масс-спектрометрического анализа бактериальных колоний, выращенных на агаре и в тканях во время инфекции

Микробиом человека представляет собой высокодинамичную экосистему, включающую молекулярные взаимодействия бактерий, вирусов, архей и других микробных эукариот. В то время как микробные отношения интенсивно изучались в последние годы, многое еще предстоит понять о микробных процессах на химическом уровне ^1,2. Отчасти это связано с отсутствием инструментов, способных точно измерять сложные микробные среды. Достижения в области масс-спектрометрии визуализации (IMS) за последнее десятилетие позволили проводить пространственное картирование in situ и без меток многих метаболитов, липидов и белков в биологических субстратах ^3,4. Матричная лазерная десорбция/ионизация (MALDI) стала наиболее распространенным методом ионизации, используемым в масс-спектрометрии изображений, включающим использование УФ-лазера для удаления материала с поверхности тонкого среза ткани для измерения с помощью масс-спектрометрии⁴. Этот процесс облегчается применением химической матрицы, равномерно нанесенной на поверхность образца, что позволяет проводить последовательные измерения в растровой схеме по всей поверхности образца. Тепловые карты интенсивности ионов анализируемого вещества затем генерируются после сбора данных. Последние достижения в области источников ионизации и методов отбора проб позволили проанализировать нетрадиционные субстраты, такие как бактериальные⁵ и ^6,7,8 клеточные образцы млекопитающих, выращенные на питательном агаре. Молекулярная пространственная информация, предоставляемая IMS, может дать уникальное представление о биохимической коммуникации взаимодействий микроб-микроб и хозяин-микроб во время инфекции 9,10,11,12,13,14.

При инфекции Clostridioides difficile (CDI) C. difficile подвергается воздействию быстро меняющейся микробной среды в желудочно-кишечном тракте, где полимикробные взаимодействия могут повлиять на исходы инфекции^15,16. Удивительно, но мало что известно о молекулярных механизмах взаимодействия между C. difficile и резидентной микробиотой во время инфекции. Например, энтерококки представляют собой класс условно-патогенных микроорганизмов в микробиоме кишечника и связаны с повышенной восприимчивостью и тяжестью CDI 17,18,19,20. Однако мало что известно о молекулярных механизмах взаимодействия между этими патогенами. Чтобы визуализировать низкомолекулярную связь между этими членами кишечного микробиома, бактериальные макроколонии были выращены здесь на агаре для имитации микроб-микробных взаимодействий и образования бактериальной биопленки в контролируемой среде. Однако получение репрезентативных метаболических распределений при масс-спектрометрическом анализе образцов бактериальных культур с помощью MALDI является сложной задачей из-за высокого содержания воды и неровной топографии поверхности этих образцов. Это в значительной степени вызвано высокой гидрофильной природой агара и неравномерной реакцией поверхности агара при удалении влаги.

Высокое содержание воды в агаре также может затруднить получение однородного матричного покрытия MALDI и может помешать последующему анализу MALDI, выполняемому в вакууме²¹. Например, многие источники MALDI работают при давлении 0,1-10 Торр, что является достаточным вакуумом для удаления влаги из агара и может вызвать деформацию образца. Эти морфологические изменения в агаре, вызванные вакуумной средой, вызывают пузырение и растрескивание в высушенном агаровом материале. Эти артефакты снижают адгезию агара к предметному стеклу и могут привести к демонтажу или отслаиванию образца в вакуумной системе прибора. Толщина образцов агара может составлять до 5 мм от предметного стекла, что может создать недостаточный зазор от ионной оптики внутри прибора, что приведет к загрязнению и/или повреждению ионной оптики прибора. Эти кумулятивные эффекты могут привести к уменьшению ионного сигнала, отражающего топографию поверхности, а не лежащие в основе микробные биохимические взаимодействия. Образцы агара должны быть однородно высушены и прочно приклеены к предметному стеклу микроскопа перед анализом в вакууме.

В данной работе демонстрируется процесс пробоподготовки для контролируемой сушки макроколоний бактериальных культур, выращенных на агаровых средах. Этот многоступенчатый, более медленный процесс сушки (по сравнению с ранее описанными) гарантирует, что агар будет равномерно обезвоживаться, сводя к минимуму эффекты барботирования или растрескивания образцов агара, установленных на предметных стеклах микроскопа. При использовании этого метода постепенной сушки образцы прочно прилегают к предметному стеклу микроскопа и поддаются последующему нанесению матрицы и анализу MALDI. Это проиллюстрировано на примере модельных бактериальных колоний C. difficile , выращенных на моделях агаровой и мышиной ткани, содержащих CDI с присутствием комменсального и условно-патогенного микроорганизма Enterococcus faecalis и без него. Масс-спектрометрический анализ MALDI как бактериальных, так и тканевых моделей позволяет пространственно картировать профили метаболитов аминокислот, обеспечивая новое понимание биоэнергетического микробного метаболизма и коммуникации.