Investigação da Cooperação Microbiana via Análise de Espectrometria de Massa por Imagem de Colônias Bacterianas Cultivadas em Ágar e em Tecido Durante a Infecção

O microbioma humano é um ecossistema altamente dinâmico que envolve interações moleculares de bactérias, vírus, archaea e outros eucariotas microbianos. Embora as relações microbianas tenham sido intensamente estudadas nos últimos anos, ainda há muito a ser compreendido sobre os processos microbianos no nível químico ^1,2. Isso se deve em parte à indisponibilidade de ferramentas capazes de medir com precisão ambientes microbianos complexos. Os avanços no campo da espectrometria de massa por imagem (IMS) na última década permitiram o mapeamento espacial in situ e livre de rótulos de muitos metabólitos, lipídios e proteínas em substratos biológicos ^3,4. A dessorção/ionização a laser assistida por matriz (MALDI) emergiu como a técnica de ionização mais comum utilizada na espectrometria de massa por imagem, envolvendo o uso de um laser UV para ablação de material da superfície de uma seção de tecido fino para medição por espectrometria de massa⁴. Este processo é facilitado pela aplicação de uma matriz química aplicada homogeneamente à superfície da amostra, permitindo que medições sequenciais sejam feitas em um padrão raster em toda a superfície da amostra. Mapas de calor das intensidades de íons do analito são então gerados após a aquisição de dados. Avanços recentes em fontes de ionização e técnicas de amostragem permitiram a análise de substratos não tradicionais, como espécimes celulares bacterianos⁵ e ^6,7,8 de mamíferos cultivados em ágar nutriente. A informação espacial molecular fornecida pelo IMS pode fornecer uma visão única sobre a comunicação bioquímica das interações micróbio-micróbio e micróbio hospedeiro durante a infecção 9,10,11,12,13,14.

Após a infecção por Clostridioides difficile (CDI), C. difficile é exposto a um ambiente microbiano em rápida mudança no trato gastrointestinal, onde as interações polimicrobianas provavelmente afetarão os desfechos da infecção^15,16. Surpreendentemente, pouco se sabe sobre os mecanismos moleculares de interações entre C. difficile e microbiota residente durante a infecção. Por exemplo, os enterococos são uma classe de patógenos comensais oportunistas no microbioma intestinal e têm sido associados ao aumento da suscetibilidade e gravidade do CDI^17,18,19,20. No entanto, pouco se sabe sobre os mecanismos moleculares das interações entre esses patógenos. Para visualizar a comunicação de pequenas moléculas entre esses membros do microbioma intestinal, macrocolônias bacterianas foram cultivadas aqui em ágar para simular interações micróbio-micróbio e formação de biofilme bacteriano em um ambiente controlado. No entanto, a obtenção de distribuições metabólicas representativas na análise de espectrometria de massa por imagem MALDI de espécimes de cultura bacteriana é um desafio devido ao alto teor de água e à topografia superficial irregular dessas amostras. Isso é em grande parte causado pela natureza altamente hidrofílica do ágar e pela resposta não uniforme da superfície do ágar durante a remoção da umidade.

O alto teor de água do ágar também pode dificultar a obtenção de um revestimento homogêneo da matriz MALDI e pode interferir na análise MALDI subsequente realizada no vacuo²¹. Por exemplo, muitas fontes MALDI operam a pressões de 0,1-10 Torr, que é um vácuo suficiente para remover a umidade do ágar e pode causar deformação da amostra. Essas alterações morfológicas no ágar induzidas pelo ambiente de vácuo causam borbulhamento e rachaduras no material de ágar seco. Esses artefatos reduzem a aderência do ágar à lâmina e podem causar desmontagem ou descamação da amostra no sistema de vácuo do instrumento. A espessura das amostras de ágar pode estar a até 5 mm da lâmina, o que pode criar folga insuficiente da óptica iônica dentro do instrumento, causando contaminação e/ou danos à óptica iônica do instrumento. Esses efeitos cumulativos podem resultar em reduções do sinal iônico reflexivo da topografia de superfície, em vez das interações bioquímicas microbianas subjacentes. As amostras de ágar devem ser secas homogeneamente e fortemente aderidas a uma lâmina de microscópio antes da análise em vácuo.

Este trabalho demonstra um fluxo de trabalho de preparação de amostras para a secagem controlada de macrocolônias de cultura bacteriana cultivadas em meio de ágar. Este processo de secagem mais lento e de várias etapas (em relação aos relatados anteriormente) garante que o ágar desidrate uniformemente, minimizando os efeitos do borbulhar ou rachadura de amostras de ágar montadas em lâminas de microscópio. Usando este método de secagem gradual, as amostras são fortemente aderidas à lâmina do microscópio e passíveis de aplicação subsequente da matriz e análise MALDI. Isso é exemplificado usando colônias bacterianas modelo de C. difficile cultivadas em modelos de tecido ágar e murino que abrigam CDI com e sem a presença de patógeno comensal e oportunista, Enterococcus faecalis. As análises de espectrometria de massa por imagem MALDI de modelos bacterianos e teciduais permitem o mapeamento espacial de perfis de metabólitos de aminoácidos, fornecendo uma nova visão sobre o metabolismo e a comunicação microbiana bioenergética.