Untersuchung der mikrobiellen Kooperation mittels bildgebender Massenspektrometrie-Analyse von Bakterienkolonien, die während der Infektion auf Agar und im Gewebe gezüchtet wurden

Das menschliche Mikrobiom ist ein hochdynamisches Ökosystem mit molekularen Wechselwirkungen von Bakterien, Viren, Archaeen und anderen mikrobiellen Eukaryoten. Während mikrobielle Beziehungen in den letzten Jahren intensiv untersucht wurden, muss noch viel über mikrobielle Prozesse auf chemischer Ebene^{verstanden werden 1,2}. Dies ist zum Teil auf die Nichtverfügbarkeit von Werkzeugen zurückzuführen, die in der Lage sind, komplexe mikrobielle Umgebungen genau zu messen. Fortschritte auf dem Gebiet der bildgebenden Massenspektrometrie (IMS) in den letzten zehn Jahren haben die räumliche Kartierung vieler Metaboliten, Lipide und Proteine in biologischen Substraten in situ und markierungsfrei ermöglicht ^3,4. Die Matrix-unterstützte Laserdesorption/-ionisation (MALDI) hat sich als die gebräuchlichste Ionisationstechnik in der bildgebenden Massenspektrometrie herausgestellt, bei der ein UV-Laser verwendet wird, um Material von der Oberfläche eines dünnen Gewebeschnitts zur Messung durch Massenspektrometrie⁴ abzutragen. Dieser Prozess wird durch das Aufbringen einer chemischen Matrix erleichtert, die homogen auf die Oberfläche der Probe aufgebracht wird, so dass sequentielle Messungen in einem Rastermuster über die Probenoberfläche durchgeführt werden können. Nach der Datenerfassung werden dann Heatmaps der Analytionenintensitäten erstellt. Jüngste Fortschritte bei Ionisationsquellen und Probenahmetechniken haben die Analyse von nicht-traditionellen Substraten wie bakteriellen⁵ und Säugetieren ^6,7,8 zellulären Proben ermöglicht, die auf Nährstoffagar gezüchtet wurden. Die molekularen räumlichen Informationen, die von IMS bereitgestellt werden, können einen einzigartigen Einblick in die biochemische Kommunikation von Mikroben-Mikroben- und Wirt-Mikroben-Interaktionen während der Infektion geben 9,10,11,12,13,14.

Bei einer Clostridioides difficile-Infektion (CDI) ist C. difficile einer sich schnell verändernden mikrobiellen Umgebung im Magen-Darm-Trakt ausgesetzt, in der polymikrobielle Interaktionen wahrscheinlich die Infektionsergebnisse beeinflussen^15,16. Überraschenderweise ist wenig über die molekularen Mechanismen der Wechselwirkungen zwischen C. difficile und residenten Mikrobiota während der Infektion bekannt. Zum Beispiel sind Enterokokken eine Klasse opportunistischer kommensaler Krankheitserreger im Darmmikrobiom und wurden mit einer erhöhten Anfälligkeit und einem erhöhten Schweregrad von CDI^17,18,19,20 in Verbindung gebracht. Über die molekularen Mechanismen der Wechselwirkungen zwischen diesen Erregern ist jedoch wenig bekannt. Um die niedermolekulare Kommunikation zwischen diesen Mitgliedern des Darmmikrobioms zu visualisieren, wurden hier bakterielle Makrokolonien auf Agar gezüchtet, um Mikroben-Mikroben-Interaktionen und bakterielle Biofilmbildung in einer kontrollierten Umgebung zu simulieren. Aufgrund des hohen Wassergehalts und der ungleichmäßigen Oberflächentopographie dieser Proben ist es jedoch schwierig, repräsentative metabolische Verteilungen bei der bildgebenden MALDI-Massenspektrometrie-Analyse von Bakterienkulturproben zu erhalten. Dies wird hauptsächlich durch die stark hydrophile Natur von Agar und die ungleichmäßige Reaktion der Agaroberfläche während der Feuchtigkeitsentfernung verursacht.

Der hohe Wassergehalt von Agar kann es auch schwierig machen, eine homogene MALDI-Matrixbeschichtung zu erreichen, und kann die anschließende MALDI-Analyse im Vakuum²¹ beeinträchtigen. Zum Beispiel arbeiten viele MALDI-Quellen mit Drücken von 0,1-10 Torr, was ein ausreichendes Vakuum ist, um Feuchtigkeit aus dem Agar zu entfernen, und eine Verformung der Probe verursachen kann. Diese morphologischen Veränderungen im Agar, die durch die Vakuumumgebung induziert werden, verursachen Blasenbildung und Rissbildung im getrockneten Agarmaterial. Diese Artefakte verringern die Haftung des Agars auf dem Objektträger und können dazu führen, dass die Probe in das Vakuumsystem des Instruments zerlegt oder abgeplatzt wird. Die Dicke der Agarproben kann bis zu 5 mm vom Objektträger entfernt sein, was zu einem unzureichenden Abstand von der Ionenoptik im Inneren des Instruments führen kann, was zu einer Kontamination und/oder Beschädigung der Instrumentenionenoptik führen kann. Diese kumulativen Effekte können zu einer Verringerung des Ionensignals führen, das die Oberflächentopographie und nicht die zugrunde liegenden mikrobiellen biochemischen Wechselwirkungen widerspiegelt. Agarproben müssen vor der Analyse im Vakuum homogen getrocknet und fest auf einem Objektträger haften.

Diese Arbeit demonstriert einen Probenvorbereitungs-Workflow für die kontrollierte Trocknung von Bakterienkultur-Makrokolonien, die auf Agarmedien gezüchtet werden. Dieser mehrstufige, langsamere Trocknungsprozess (im Vergleich zu den zuvor berichteten) stellt sicher, dass der Agar gleichmäßig dehydriert und gleichzeitig die Auswirkungen von Blasenbildung oder Rissbildung von Agarproben, die auf Objektträgern montiert sind, minimiert werden. Durch die Verwendung dieser schrittweisen Trocknungsmethode werden die Proben fest auf dem Objektträger haftbar und sind für die anschließende Matrixapplikation und MALDI-Analyse geeignet. Dies wird anhand von Modellbakterienkolonien von C. difficile veranschaulicht, die auf Agar- und Mausgewebemodellen gezüchtet wurden, die CDI mit und ohne das Vorhandensein von kommensalem und opportunistischem Erreger, Enterococcus faecalis, beherbergen. Die bildgebenden Massenspektrometrie-Analysen von Bakterien- und Gewebemodellen von MALDI ermöglichen die räumliche Kartierung von Aminosäure-Metabolitenprofilen und bieten neue Einblicke in den bioenergetischen mikrobiellen Stoffwechsel und die Kommunikation.