Gli espianti retinici ottenuti da macachi selvatici sono stati coltivati in vitro. La degenerazione retinica e la via di segnalazione cGMP-PKG sono state indotte utilizzando l’inibitore della PDE6 zaprinast. L’accumulo di cGMP negli espianti a diverse concentrazioni di zaprinast è stato verificato utilizzando l’immunofluorescenza.
La degenerazione retinica ereditaria (RD) è caratterizzata dalla progressiva morte delle cellule dei fotorecettori. L’iperattivazione della via ciclica della proteina chinasi dipendente dalla guanosina monofosfato (cGMP) (PKG) nelle cellule dei fotorecettori causa la morte delle cellule dei fotorecettori, specialmente nei modelli che ospitano mutazioni della fosfodiesterasi 6b (PDE6b). Precedenti studi sulla RD hanno utilizzato principalmente modelli murini come topi rd1 o rd10 . Date le differenze genetiche e fisiologiche tra topi e umani, è importante capire fino a che punto le retine di primati e roditori sono comparabili. I macachi condividono un alto livello di somiglianza genetica con gli esseri umani. Pertanto, i macachi selvatici (di età compresa tra 1-3 anni) sono stati selezionati per la coltura in vitro di espianti retinici che includevano il complesso epitelio pigmentato retinico-retinico (RPE)-coroide. Questi espianti sono stati trattati con diverse concentrazioni dell’inibitore della PDE6 zaprinast per indurre la via di segnalazione cGMP-PKG e simulare la patogenesi RD. L’accumulo di cGMP e la morte cellulare negli espianti retinici dei primati sono stati successivamente verificati utilizzando l’immunofluorescenza e il saggio TUNEL. Il modello retinico dei primati stabilito in questo studio può servire per studi pertinenti ed efficaci sui meccanismi della RD cGMP-PKG-dipendente, nonché per lo sviluppo di futuri approcci terapeutici.
La degenerazione retinica ereditaria (RD) è caratterizzata dalla progressiva morte delle cellule dei fotorecettori ed è causata da mutazioni in un’ampia varietà di geni patogeni1. Il risultato finale della RD è la perdita della vista e nella stragrande maggioranza dei casi la malattia rimane incurabile fino ad oggi. Pertanto, è importante studiare i meccanismi cellulari che portano alla morte dei fotorecettori utilizzando modelli che rappresentino fedelmente la condizione della malattia umana. Qui, i modelli basati sui primati sono di particolare interesse a causa della loro vicinanza agli esseri umani. In particolare, tali modelli possono far progredire lo sviluppo di interventi terapeutici appropriati che possono arrestare o ritardare la morte cellulare dei fotorecettori.
Precedenti ricerche sui meccanismi di morte cellulare nella RD hanno dimostrato che la diminuzione o la perdita dell’attività della fosfodiesterasi 6 (PDE6) causata da mutazioni geniche che innescano RD porta a una ridotta idrolisi del guanosina monofosfato ciclico (cGMP)2,3. cGMP è un agonista specifico dei canali ionici ciclici nucleotide-dipendenti (CNGC) nei segmenti esterni dei bastoncelli (ROS) ed è anche una molecola chiave responsabile della conversione dei segnali luminosi in segnali elettrici nelle cellule fotorecettrici dei vertebrati4. La ridotta idrolisi del cGMP provoca l’accumulo di cGMP nei ROS, portando all’apertura dei CNGC 5. Di conseguenza, le vie di fototrasduzione vengono attivate, con conseguente aumento delle concentrazioni di cationi nelle cellule dei fotorecettori. Questo processo impone un carico metabolico sui fotorecettori, che se sovraattivato, ad esempio, da mutazioni nella PDE6, può causare la morte cellulare.
Molti studi hanno dimostrato che un significativo sovraaccumulo di cGMP nei fotorecettori di modelli murini con diverse mutazioni del gene RD può causare l’attivazione della proteina chinasi cGMP-dipendente (PKG)3,6. Ciò porta ad un sostanziale aumento delle cellule morenti, TUNEL-positive e ad un graduale assottigliamento dello strato cellulare del fotorecettore. Studi precedenti suggeriscono che la sovraattivazione di PKG causata da elevati livelli di cGMP è una condizione necessaria e sufficiente per l’induzione della morte cellulare dei fotorecettori 2,5. Studi su diversi modelli murini di RD hanno anche dimostrato che l’attivazione di PKG, indotta da elevati livelli di cGMP nei fotorecettori, porta a una sovraattivazione degli effettori a valle come la poli-ADP-ribosio polimerasi 1 (PARP1), l’istone deacetilasi (HDAC) e la calpain 2,7,8,9. Ciò implica associazioni causali tra queste diverse proteine bersaglio e la morte delle cellule dei fotorecettori.
Tuttavia, la ricerca precedente sulla patologia, tossicofarmacologia e terapia della RD si basava principalmente su modelli murini per RD10,11,12. Tuttavia, permangono immense difficoltà nella traduzione clinica di questi risultati. Ciò è dovuto alle notevoli differenze genetiche e fisiologiche tra topi e umani, soprattutto per quanto riguarda la struttura retinica. Al contrario, i primati non umani (NHP) condividono anche un alto grado di somiglianza con gli esseri umani per quanto riguarda le caratteristiche genetiche, i modelli fisiologici e la regolazione dei fattori ambientali. Ad esempio, la terapia optogenetica è stata studiata come mezzo per ripristinare l’attività retinica in un modello NHP13. Lingam e colleghi hanno dimostrato che le cellule precursori dei fotorecettori retinici derivati da cellule staminali pluripotenti derivate da cellule staminali di buona fabbricazione possono salvare il danno del fotorecettore del cono in NHP14. Pertanto, i modelli NHP sono importanti per l’esplorazione della patogenesi RD e lo sviluppo di metodi di trattamento efficaci. In particolare, i modelli NHP di RD, che presentano meccanismi patogenetici simili a quelli dell’uomo, potrebbero svolgere un ruolo critico negli studi sullo sviluppo e nell’analisi tossicofarmacologica in vivo di nuovi farmaci.
In considerazione del lungo ciclo di vita, dell’elevato livello di difficoltà tecniche e degli elevati costi necessari per stabilire modelli di primati in vivo, abbiamo stabilito un modello in vitro di primati non umani (NHP) utilizzando colture di retina di macaco espiantata. In primo luogo, i macachi selvatici di età compresa tra 1 e 3 anni sono stati selezionati per la coltura in vitro di espianti retinici, che includevano il complesso retina-RPE-coroide. Gli espianti sono stati quindi trattati con diverse concentrazioni dell’inibitore della PDE6 zaprinast (100 μM, 200 μM e 400 μM) per indurre la via di segnalazione cGMP-PKG. La morte cellulare dei fotorecettori è stata quantificata e analizzata utilizzando il test TUNEL e l’accumulo di cGMP negli espianti è stato verificato tramite immunofluorescenza. Dato l’elevato grado di somiglianza rispetto alla distribuzione cellulare e alla morfologia, allo spessore dello strato retinico e ad altre caratteristiche fisiologiche della retina tra scimmie e umani, la creazione della via di segnalazione cGMP-PKG nel modello retinico in vitro può facilitare la ricerca futura sulla patogenesi della RD, nonché gli studi sullo sviluppo e la tossicofarmacologia di nuovi farmaci per il trattamento delle RD.
La fototrasduzione visiva si riferisce al processo biologico mediante il quale i segnali luminosi vengono convertiti in segnali elettrici dalle cellule dei fotorecettori all’interno della retina dell’occhio. Le cellule dei fotorecettori sono neuroni polarizzati capaci di fototrasduzione, e ci sono due diversi tipi di fotorecettori chiamati coni e bastoncelli dopo le forme dei loro segmenti esterni. I bastoncelli sono responsabili della visione scotopica e i coni sono responsabili della visione fotopica e ad alta acuità….
The authors have nothing to disclose.
Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni della National Natural Science Foundation of China (n. 81960180), della Zinke Heritage Foundation e della Charlotte and Tistou Kerstan Foundation, Yunnan Eye Disease Clinical Medical Center (ZX2019-02-01). Ringraziamo il Prof. Longbao Lv (Istituto di Zoologia, Accademia Cinese delle Scienze, Kunming, Cina) per aver condiviso i bulbi oculari delle scimmie utilizzati in questo studio.
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | B2064 | Blocking solution |
Corticosterone | Sigma | C2505 | Supplements of Complete Medium |
DL-tocopherol | Sigma | T1539 | Supplements of Complete Medium |
Donkey anti sheep, Alxea Fluor 488 | Life technologies corporation | A11015 | Secondary antibody of cGMP |
Ethanol-acetic acid solution | Shyuanye | R20492 | Fixing liquid |
Fetal Bovine Serum | Gemini | 900-108 | Blocking solution |
Fluorescence microscope | Carl Zeiss | Axio Imager.M2 | Immunofluorescence imaging |
Glutamine | Sigma | G8540 | Supplements of Complete Medium |
Glutathione | Sigma | G6013 | Supplements of Complete Medium |
In Situ Cell Death Detection Kit, TMR red | Roche | 12156792910 | TUNEL assay |
Insulin | Sigma | 16634 | Supplements of Complete Medium |
L-cysteine HCl | Sigma | C7477 | Supplements of Complete Medium |
Linoleic acid | Sigma | L1012 | Supplements of Complete Medium |
MACS Tissue Storage Solution | Miltenyi | 130-100-008 | Optimized storage of fresh organ and tissue samples |
Normal Donkey Serum | Solarbio | SL050 | Blocking solution |
Paraformaldehyde(PFA) | Biosharp | BL539A | Fixing agent |
PEN. / STREP. 100× | Millipore | TMS-AB2-C | Penicillin / Streptomycin antibiotics |
Phosphate buffer saline(PBS) | Solarbio | P1010 | Buffer solution |
Povidone-iodine | Shanghailikang | 310411 | Disinfector agent |
Progesterone | Sigma | P8783 | Supplements of Complete Medium |
Proteinase K | Millpore | 539480 | Break down protein |
R16 medium | Life technologies corporation | 074-90743A | Basic medium |
Retinol | Sigma | R7632 | Supplements of Complete Medium |
Retinyl acetate | Sigma | R7882 | Supplements of Complete Medium |
Sheep anti-cGMP | Jan de Vente, Maastricht University, the Netherlands | Primary antibody of cGMP | |
Sucrose | GHTECH | 57-50-1 | Dehydrating agent |
T3 | Sigma | T6397 | Supplements of Complete Medium |
Tissue-Tek medium (O.C.T. Compound) | SAKURA | 4583 | Embedding medium |
Tocopheryl acetate | Sigma | T1157 | Supplements of Complete Medium |
Transferrin | Sigma | T1283 | Supplements of Complete Medium |
Transwell | Corning Incorporated | 3412 | Cell / tissue culture |
Tris-buffer (TBS) | Solarbio | T1080 | Blocking buffer |
Triton X-100 | Solarbio | 9002-93-1 | Surface active agent |
VECTASHIELD Medium with DAPI | Vector | H-1200 | Mounting medium |
Vitamin B1 | Sigma | T1270 | Supplements of Complete Medium |
Vitamin B12 | Sigma | V6629 | Supplements of Complete Medium |
Vitamin C | Sigma | A4034 | Supplements of Complete Medium |
Zaprinast | Sigma | Z0878 | PDE6 inhibitor |
Zeiss Imager M2 Microscope | Zeiss, Oberkochen,Germany | upright microscope | |
LSM 900 Airyscan | high resolution laser scanning microscope | ||
Zeiss Axiocam | Zeiss, Oberkochen,Germany | digital camera | |
Zeiss Axiovision4.7 | |||
Adobe | |||
Illustrator CC 2021 (Adobe Systems Incorporated, San Jose, CA) | |||
Primate eyeballs from wildtype macaque | KUNMING INSTITUTE OF ZOOLOGY | SYXK () K2017 -0008 | |
Super Pap Pen Pen (Liquid Blocker, Diado, 0010, Japan | |||
TUNEL kit solution (REF12156792910, Roche,Germany), |