In vitro Digestão de emulsões em uma única gotícula via troca multifásica de fluidos gastrointestinais simulados

Entender como a gordura é digerida, o que envolve a digestão em emulsão, é importante para projetar racionalmente produtos com funcionalidade personalizada¹. O substrato para a digestão de gordura é uma emulsão, uma vez que a gordura é emulsionada após o consumo por ação mecânica e mistura com biossurfactantes na boca e no estômago. Além disso, a maior parte da gordura consumida pelos seres humanos já é emulsionada (como produtos lácteos) e, no caso de bebês ou alguns idosos, essa é a única forma de consumo. Assim, o design de produtos à base de emulsão com perfis de digestão específicos é muito importante na nutrição¹. Além disso, as emulsões podem encapsular e fornecer nutrientes, medicamentos ou bioativos lipofílicos² para lidar com diferentes condições gastrointestinais, como obesidade³, fortificação de nutrientes, alergias alimentares e doenças digestivas. Nas emulsões de óleo em água, as gotículas lipídicas são cercadas por camadas interfaciais de emulsificantes, como proteínas, surfactantes, polímeros, partículas e misturas⁴. O papel dos emulsificantes é duplo: estabilizar a emulsão⁵ e proteger/transportar o composto encapsulado para um local específico. A obtenção de uma digestibilidade personalizada das emulsões depende de sua composição inicial, mas também requer o monitoramento da evolução contínua dessa interface durante o trânsito pelo trato gastrointestinal (Figura 1).

Figura 1: Aplicando engenharia interfacial de emulsões para lidar com algumas das principais condições gastrointestinais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A digestão lipídica é, em última análise, um processo interfacial, pois requer a adsorção de lipases (gástricas ou pancreáticas) na interface óleo-água de gotículas lipídicas emulsionadas através da camada interfacial para alcançar e hidrolisar os triglicerídeos contidos no óleo em ácidos graxos livres e monoacilglicerídeos⁶. Isso está esquematizado na Figura 2. A lipase gástrica compete com a pepsina e os fosfolipídios no estômago pela interface óleo-água (Figura 2, digestão gástrica). Em seguida, a lipase/colipase pancreática compete com tripsina/quimotripsina, fosfolipídios, sais biliares e produtos digestivos no intestino delgado. As proteases podem alterar a cobertura interfacial, prevenindo ou favorecendo a adsorção da lipase, enquanto os sais biliares são altamente ativos superficiais e deslocam a maior parte do emulsificante restante para promover a adsorção da lipase (Figura 2, digestão intestinal). Eventualmente, a taxa e a extensão da lipólise dependem das propriedades interfaciais da emulsão digerida inicial/gástrica, como a espessura, as conexões inter/intramoleculares e as interações eletrostáticas e estéricas. Assim, o monitoramento da evolução da camada interfacial à medida que é digerida oferece uma plataforma experimental para identificar mecanismos e eventos interfaciais que afetam a adsorção da lipase e, portanto, a digestão lipídica.

Figura 2: Diagrama esquemático ilustrando o papel das interfaces na digestão lipídica gastrointestinal. A hidrólise da pepsina altera a composição interfacial na fase gástrica, enquanto a lipase gástrica hidrolisa os triglicerídeos. No intestino delgado, a tripsina/quimotripsina hidrolisa ainda mais o filme interfacial, enquanto a lipólise prossegue pela adsorção de BS/lipases, pela hidrólise de triglicerídeos e pela dessorção de produtos lipolíticos por solubilização nas micelas/complexo BS. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

O equipamento de gota de pingente da Universidade de Granada (UGR) é implementado com uma tecnologia patenteada, o duplo capilar coaxial, que permite a troca subfásica da solução a granel⁷. O capilar, que contém a gota do pingente, consiste em um arranjo de dois capilares coaxiais que são conectados independentemente a cada canal de um microinjetor duplo. Cada microinjetor pode operar de forma independente, permitindo a troca do conteúdo caído pelo fluxo⁷. Assim, a troca subfásica consiste na injeção simultânea da nova solução com o capilar interno e na extração da solução a granel com o capilar externo usando a mesma taxa de fluxo. Este processo permite a substituição da solução a granel sem perturbação da área interfacial ou do volume da gota. Este procedimento foi posteriormente atualizado para uma troca multi-subfase, que permite até oito trocas subfásicas sequenciais da solução a granel de gotículas⁸. Isso permite a simulação do processo digestivo em uma única gota aquosa suspensa em meio lipídico, trocando sequencialmente a solução a granel por meios artificiais imitando os diferentes compartimentos (boca, estômago, intestino delgado). Toda a configuração é representada na Figura 3, incluindo os detalhes dos componentes. As seringas do microinjetor são conectadas às oito válvulas vias, cada uma conectando-se a um tubo de microcentrífuga contendo o fluido digestivo artificial com componentes descritos na Figura 2.

Figura 3: Visão geral do OCTOPUS com todos os componentes. A câmera CCD, o microscópio, o microposicionador, a célula termoestabilizada e o capilar duplo foram conectados independentemente a um microinjetor duplo com duas seringas conectadas a oito válvulas vias. Cada seringa se conecta com capilares, quatro tubos de microcentrífuga com amostra e uma descarga. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A Figura 4A mostra como cada um dos fluidos digestivos artificiais é injetado na gota pendente por troca de subfases através do duplo capilar. Cada composto digestivo detalhado na Figura 2 pode ser aplicado simultaneamente/sequencialmente, simulando a passagem pelo trato gastrointestinal. Os fluidos digestivos artificiais contêm diferentes enzimas e biossurfactantes, que alteram a tensão interfacial do emulsificante inicial, conforme esquematizado na Figura 4B. O software DINATEN (ver Tabela de Materiais), também desenvolvido na UGR, registra a evolução da tensão interfacial em tempo real à medida que a camada interfacial inicial é digerida in vitro. Além disso, após cada fase digestiva, a elasticidade dilatacional da camada interfacial é calculada impondo oscilações periódicas de volume/área interfacial na camada interfacial estabilizada e registrando a resposta da tensão interfacial. O período/frequência e a amplitude da oscilação podem ser variados, e o processamento da imagem com o software CONTACTO fornece os parâmetros reológicos dilatacionais⁸.

Figura 4: Exemplos de perfis de digestão . (A) A camada emulsificante inicial é submetida a meio digestivo artificial colocado na microcentrífuga por troca subfásica sequencial das diferentes soluções na gota pendente. (B) A evolução geral da tensão interfacial (eixo y) do emulsionante inicial em função do tempo (eixo x) à medida que é digerido in vitro pelas várias enzimas/biossurfactantes nos meios artificiais. Uma troca subfásica final com fluido intestinal simples mede a dessorção de lipídios digeridos por solubilização em micelas mistas. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Este estudo apresenta o protocolo geral desenhado para medir a digestão in vitro de camadas interfaciais com equipamento de gota pendente⁹. A camada interfacial inicial é submetida sequencialmente a condições que imitam a passagem pelo trato gastrointestinal, conforme ilustrado na Figura 2. Esses diferentes meios digestivos são injetados na gota pendente por troca subfásica das diferentes soluções contidas nos tubos de microcentrífuga (Figura 4A). A composição desses meios pode ser personalizada dependendo das condições gastrointestinais que serão avaliadas, a saber, proteólise/lipólise gástrica/intestinal, permitindo mensurar efeitos cumulativos e sinergias¹⁰. As condições experimentais utilizadas para mimetizar o processo de digestão em cada compartimento seguem o protocolo de consenso internacional publicado pelo INFOGEST detalhando o pH e as quantidades de eletrólitos e enzimas¹¹. O dispositivo experimental baseado na gota pendente permite o registro da tensão interfacial in situ durante todo o processo de digestão simulado. A reologia dilatacional da camada interfacial é calculada no final de cada etapa digestiva. Dessa forma, cada emulsificante oferece um perfil de digestão que ilustra as propriedades das interfaces digeridas, conforme ilustrado na Figura 4B. Isso permite a extração de conclusões sobre sua suscetibilidade ou resistência às diferentes etapas do processo digestivo. Em geral, o meio digestivo artificial contém pH ácido/básico, eletrólitos, proteases (gástricas e intestinais), lipases (gástricas e intestinais), sais biliares e fosfolipídios, que são dissolvidos em seus respectivos fluidos digestivos (gástrico ou intestinal). A Figura 4B mostra um perfil genérico da evolução da tensão interfacial de um emulsificante, primeiro submetido à ação da protease, seguido pelas lipases. Em geral, a proteólise da camada interfacial promove um aumento da tensão interfacial devido à dessorção de peptídeos hidrolisados^9,12, enquanto a lipólise resulta em uma redução muito acentuada da tensão interfacial devido à adsorção de sais biliares e lipases ¹³. Uma troca subfásica final com o fluido intestinal esgota a solução a granel de material não adsorvido/digerido e promove a dessorção de compostos solúveis e a solubilização de lipídios digeridos em micelas mistas. Isso é quantificado pelo aumento da tensão interfacial registrada (Figura 4B).

Em resumo, o delineamento experimental implementado na gota pendente para simular a digestão in vitro em uma única gota permite medir efeitos cumulativos e sinergias à medida que o processo de digestão é aplicado sequencialmente à camada interfacial inicial¹⁰. A composição de cada meio digestivo pode ser facilmente ajustada para dar conta das particularidades das condições digestivas, incluindo patologias gastrointestinais ou meios digestivos infantis¹⁴. Em seguida, a identificação dos mecanismos interfaciais que afetam a proteólise e a lipólise pode ser usada para modular a digestão pela engenharia interfacial de emulsões. Os resultados obtidos podem ser aplicados no desenho de novas matrizes alimentares com funcionalidades sob medida, como baixa alergenicidade, ingestão controlada de energia e digestibilidade diminuída 15,16,17,18,19.