通过配对秀丽隐杆线虫中的两种化学物质来形成厌恶联想学习和记忆形成

1. 食谱 NGM琼脂平板（步骤2.1.）要制备 6 cm NGM 平板，将 2.5 g 蛋白胨、3 g NaCl 和 17 g 琼脂溶解在 850 mL 双去离子 H 2 O （ddH2O） 中。使用 ddH2O 时，总体积达到 972 mL。 高压灭菌后，冷却至 ~65 °C，加入 1 mL 溶于乙醇中的 5 mg/mL 胆固醇、1 M CaCl2 和 1 M MgSO4 各 1 mL 以及 25 mL 1 M 磷酸钾 （pH 6.0）。充分混合后，将 8 mL 各分配到 6 cm（直径）培养皿中。 将带盖板放在室温 （RT） 下的工作台上 1 天，然后将它们保存在冷藏室的塑料器皿中直至使用。 通过将10g胰蛋白胨，5g酵母提取物和10gNaCl溶解在1L ddH 2 O中来制备Luria-Bertani（LB）培养基（步骤2.1.）。 用5N NaOH（几滴）将pH调节至7.0并通过高压灭菌灭菌。通过将15克琼脂添加到LB培养基中来制备LB平板。高压灭菌后，冷却至~60°C，并将每个12mL分配到9cm（直径）培养皿中。将盘子放在冷藏室的塑料器皿中，直到使用。 要制作动物收集器（步骤2.4.），用胶水将尼龙网（30μm网格尺寸）连接到透明丙烯酸圆柱管（长3.5厘米，外径3厘米，壁厚2毫米）的底部。 要制成0.25%的明胶水溶液（步骤2.4.），将0.25g明胶溶解在100mL的ddH2O中。 趋化性测定板（步骤5.1.）为了制作用于趋化性测定的琼脂平板，通过高压灭菌将15g琼脂溶解在993mL的ddH2O中，并将溶液冷却至~65°C。 然后，向琼脂溶液中加入 5 mL 高压灭菌的 1 M 磷酸钾 （pH 6.0）、1 mL 1 M CaCl2 和 1 mL 1 M MgSO4 。所有这些溶液都通过高压灭菌单独灭菌。 将 10 mL 混合溶液分配到 6 cm 培养皿中。将这些带盖的盘子放在室温工作台上两天，然后将它们放在室温塑料器皿中的湿纸巾上直至使用。这些板最多可以使用 10 天。 为了制备趋化性测定缓冲液（步骤5.4.），混合5mL的1M磷酸钾（pH 6.0），1mL的1M CaCl 2， 1mL的1M MgSO4和993mL的ddH2O。 要制备 40 mL CS/US 混合物溶液（1% 1-丙醇水溶液和 HCl [pH 4.0]）（步骤 3.1. 和步骤 4.1.），将 0.4 mL 绝对 1-丙醇和 4 μL 5 M HCl（终浓度为 0.1 mM）加入 39.6 mL ddH2O 中。 要使ddH 2 O，请使用净水系统处理自来水2倍（请参阅 材料表）。 通过将用牙签接种新鲜菌落到10mLLB培养基中并在37°C孵育7-8小时，制备大肠杆菌OP50的液体培养物（OD600 = ~0.7）。培养时间较长的细菌会影响调理的结果，可能是由于次级代谢物。 2.同步C的制备。 秀丽隐杆线虫 使用标准方法26，在6厘米NGM板上培养动物（步骤1.1）。通过在LB培养基中散布0.2mL大 肠杆菌 OP50液体培养物（参见步骤1.9.）并在室温下孵育不超过24小时（旧细菌会影响预处理结果）来制备NGM板。注意： 秀丽隐杆线虫的 学习和记忆对机械、化学和温度应力极其敏感。因此，强烈建议培养动物，保持包括水在内的所有试剂，并在17°C至20°C之间的室温下进行所有测定。 必须避免物理和机械刺激，如涡旋、粗移液和离心。新鲜的1-丙醇应最多每3个月使用一次，原因不明。重要的是，动物必须用大量的食物来饲养，因为饥饿会严重影响条件反射的结果。 在第1天，用铂蠕虫采摘器将五只喂食良好的妊娠动物（放更多缓慢产卵的突变动物）放在四个6厘米NGM板上，并让它们在室温下产~50个卵3小时以获得同步的成年动物种群。通过用铂金蠕虫采摘器从盘子中取出亲本动物来停止产卵。注意：种子板应保持在室温下，以尽量减少对动物的压力。 在室温下培养动物约5天，这是动物达到成熟成年阶段所需的时间，而不是年轻成年阶段。注意：4.5天至5.5天的培养期应根据条件进行调整，因为年轻的成年动物比成熟的成年动物对用于调理的化学物质更敏感（补充图1）。经过调理后，较年轻的成年动物可能表现出较低的趋化指数（CI）值。 用1mL的0.25%明胶水溶液洗涤每个板（步骤1.4），在动物收集器中收集~200只成年动物（参见步骤1.4）。这种水性明胶可防止动物粘附在移液器吸头等塑料表面。 用ddH 2 O（步骤1.8.）洗涤收集器中的动物，方法是在~10 mLddH2 O中非常轻轻地上下移动收集器2倍。注意：细菌污染严重影响动物的趋化性。 3. 短期联想学习和记忆的大规模训练 注意：有关大规模训练工作流，请参阅 图 1 。 将含有~200只动物的动物收集器轻轻浸入40mL的1%1-丙醇和HCl（与1-丙醇混合后pH 4.0;参见步骤1.7）的混合物中~1秒。注意：对于对照动物，做同样的事情，但只浸入1%的1-丙醇水溶液中。最好只用HCl（pH 4.0）治疗动物作为另一种对照。 通过将收集器1x非常轻柔地浸入6孔组织培养板孔中的10mL ddH2O中，洗涤收集器中的动物。注意：此洗涤步骤必须非常温和，并且只能进行 1 次，因为大量洗涤可能会阻止学习。 重复步骤 3.1。和 3.2.10倍无中断（试验间隔[ITI]，0分钟）。注意：每次在室温下使用新鲜的 ddH2O。 将收集器放在6cm NGM板上的大 肠杆菌 OP50草坪上，在室温下放置10分钟，以使动物休息。 用 ddH2O 洗涤收集器中的动物，方法是在 ~10 mL ddH 2 O 中非常轻轻地上下移动收集器2 倍。 重复此过程 2 倍（总共 3 倍），每次用 ~10 mLddH 2O 进行，以防止细菌污染。 如下所述进行趋化性测定（步骤5）。 4. 长期联想学习和记忆的间隔训练 注意：有关间隔训练工作流，请参阅 图 2 。 将含有~200只动物的动物收集器轻轻浸入40mL的1%1-丙醇和HCl（与1-丙醇混合后pH 4.0;参见步骤1.7）的混合物中~1.0秒。注意：仅对1%水溶液1-丙醇作为对照执行相同的操作。最好只用HCl（pH 4.0）治疗动物作为另一种对照。 通过将收集器1x非常短暂地浸入6孔组织培养板孔中的10mL ddH2O中来洗涤收集器中的动物。注意：这种洗涤必须非常简短，因为大量的洗涤可能会妨碍学习。 将收集器放在NGM琼脂平板上的大 肠杆菌 OP50草坪上，在6厘米（直径）培养皿中在室温下放置10分钟，以使动物休息。注意：休息10分钟，因为ITI对于动物巩固LTM形成的记忆至关重要。 重复步骤 4.1.-4.3。10倍。 用 ddH2O 非常轻柔地将收集器在 ~10 mL 的 ddH 2 O 中上下移动 2 倍，以洗涤收集器中的动物，保持在室温下。 重复此过程 2 倍（总共 3 倍），每次用 ~10 mL ddH2O 进行，以防止细菌污染。 如下所述进行趋化性测定（步骤5）。 5. 趋化性测定 在6cm塑料培养皿中制备琼脂平板用于趋化性测定（参见步骤1.5）。 将动物转移到收集器（步骤2.5.）中，将其放置在塑料培养皿盖的平坦表面上，使用锯掉的移液器尖端与1mL0.25%水性明胶使用锯掉的移液管尖端具有>1mm（内径）开口。注意：使用锯掉的移液器吸头以最大程度地减少对动物的剪切应力非常重要。 在动物通过重力沉淀在管底部~1分钟后，从管中取出上清液（不要离心）。 轻轻地将动物重悬于1mL趋化性测定缓冲液中（参见步骤1.6.），并让它们在重力作用下沉降到管底部~1分钟（不要离心）。通过移液尽可能多地去除上清液。 同时，以相同的方式在两个地方对角点4 μL的5%水性1-丙醇，并在另外两个地方点4 μL的ddH2O，如图 3A所示。对于对1-丙醇敏感性较低的突变体的趋化性测定，发现较高浓度的1-丙醇水溶液，导致幼稚突变体的趋化指数（C.I.）值~0.6，如 补充表1所示。注意：尽快完成发现程序很重要。点缀5%水溶液1-丙醇，因为1%水溶液1-丙醇太弱而无法在趋化性测定中吸引动物。相反，使用1%的1-丙醇水溶液进行预处理，因为用浓度高于1%的1-丙醇水溶液处理的动物显示出较低的CI值。 在趋化性测定缓冲液（步骤5.4.）中点缀含有~60只动物的动物悬浮液的6μL部分，用于趋化性测定，使用锯掉的移液器吸头具有~1.0mm（内径）开口。用实验室组织芯尽可能多地去除液体，不要接触动物，并在盘子上盖上盖子。注意：尽快完成这些过程非常重要。 让动物在室温下在平板上自由移动10分钟，然后将板转移到冰上的玻璃培养皿中3分钟以停止趋化性。然后，将盘子放在冰箱中，直到计算盘子上的动物数量。 在体视显微镜下计算四个部分中的动物数量，除了中心圆中的动物，并使用图3B所示的方程计算趋化指数（C.I.）。根据 C.I. 值，计算学习指数 （L.I.） 值作为参考动物的 C.I. 值与条件动物的 CI 值之间的差值（L.I. = C.I.参考 – C.I.条件）。注意：参考动物的C.I.值（C.I.参考）是仅用1%1-丙醇水溶液调节的动物的C.I.值的平均值。