여기에서 우리는 깨어 있는 마우스에서 소교세포 역학과 신경 활동의 동시 이미징을 위해 아데노 관련 바이러스 주입과 두개골 창 이식을 결합한 프로토콜을 설명합니다.
뇌 기능은 말초 조직에서 파생된 신호의 지속적인 영향을 받기 때문에 뇌의 신경교세포가 말초의 다양한 생물학적 상태를 감지하고 신호를 뉴런으로 전달하는 방법을 밝히는 것이 중요합니다. 뇌의 면역 세포인 미세아교세포는 시냅스 발달과 가소성에 관여합니다. 따라서 신체의 내부 상태에 대한 반응으로 신경 회로 구성에 대한 미세아교세포의 기여도는 소교세포 역학과 신경 활동 사이의 관계에 대한 생체 내 이미징에 의해 비판적으로 테스트되어야 합니다.
여기에서 우리는 깨어 있는 생쥐에서 소교세포 역학과 신경 활동을 동시에 이미징하는 기술을 설명합니다. 적색 형광 단백질의 유전자 인코딩 칼슘 지표인 R-CaMP를 코딩하는 아데노 관련 바이러스를 미세아교세포에서 EGFP를 발현하는 CX3CR1-EGFP 형질전환 마우스의 일차 시각 피질의 2/3층에 주입했습니다. 바이러스 주사 후, 주사 부위의 뇌 표면에 두개골 창을 설치했습니다. 수술 4주 후 깨어 있는 생쥐의 생체 내 이광자 이미징은 신경 활동과 소교세포 역학이 1초 미만의 시간 해상도에서 동시에 기록될 수 있음을 입증했습니다. 이 기술은 소교세포 역학과 신경 활동 사이의 조정을 밝힐 수 있으며, 전자는 말초 면역 상태에 반응하고 후자는 내부 뇌 상태를 암호화합니다.
신체의 내부 상태가 동물의 뇌 기능에 지속적으로 영향을 미친다는 증거가 늘어나고 있습니다 1,2,3,4,5. 따라서 뇌 기능에 대한 더 깊은 이해를 얻으려면 뇌의 신경교 세포가 말초의 생물학적 상태를 모니터링하고 정보를 뉴런에 전달하는 방법을 밝히는 것이 중요합니다.
뇌의 면역 세포인 미세아교세포는 시냅스 발달과 가소성에 관여하며, 이는 뇌의 신경 회로의 특성을 조각합니다 6,7,8,9. 예를 들어, Wake et al.의 선구적인 연구는 소교세포 과정이 마우스 신피질에서 뉴런 활동 의존적 방식으로 시냅스와 접촉하고 인공 허혈이 미세아교세포와 장기간 접촉한 후 시냅스 손실을 유발한다는 것을 입증했습니다10. Tremblay et al. 시각적 경험의 변화가 시냅스와의 소교 세포 상호 작용의 양식을 변화시킨다는 것을 발견했다. 일차 시각 피질(V1)의 수지상 척추 회전율이 양안 박탈에 의해 증가하는 중요한 기간 동안, 암흑 적응은 소교세포 과정의 운동성을 감소시키고 시냅스 틈새와의 접촉 빈도와 미세아교세포에 내포된 세포 개재물의 수를 모두 증가시킨다11. 이러한 결과는 소교세포 과정이 신경 활동과 주변 환경을 감지하여 신경 회로를 리모델링한다는 것을 시사합니다. 또한, 최근 연구에 따르면 소교세포 감시는 깨어 있는 상태와 마취된 상태 간에 차이가 있으며, 이는 생리학적 조건에서 뉴런-미세아교세포 통신을 조사하기 위해 깨어 있는 마우스를 사용한 실험의 중요성을 시사한다12.
생체 내 이광자 칼슘 이미징은 살아있는 동물13,14,15에서 동시에 수백 개의 뉴런에서 진행 중인 뉴런 발화를 반영하는 칼슘 역학을 기록하는 강력한 도구입니다. 뉴런의 칼슘 이미징은 일반적으로 빠른 뉴런 반응을 추적하기 위해 수 Hz 이상의 시간 분해능을 필요로 한다16,17. 대조적으로, 소교세포 역학을 추적하는 이전 연구에서는 0.1Hz 미만의 비교적 낮은 시간 분해능에서 소교세포 구조를 샘플링했습니다18,19,20. 최근의 한 연구에서는 뉴런-미세아교세포 통신을 이해하기 위해 동시 이광자 이미징을 적용했습니다21. 그러나 동적 소교 세포가 깨어있는 마우스에서 수 Hz 이상의 시간적 해상도로 주변 신경 활동에 어떻게 반응하는지는 여전히 불분명합니다. 이 문제를 해결하기 위해 우리는 깨어 있는 마우스에서 1Hz 이상의 시간 해상도를 가진 신경 활동과 소교세포 역학의 동시 생체 내 이광자 이미징 방법을 설명합니다. 이 방법을 사용하면 더 높은 프레임 속도(픽셀 프레임 크기가 512 x 512픽셀인 최대 30Hz)로 깨어 있는 마우스에서 안정적인 이미징을 달성할 수 있으며 미세아교세포의 감시 행동 또는 깨어 있는 마우스의 신경 활동과의 상호 작용을 조사하는 데 더 유리한 방법을 제공합니다.
우리는 깨어 있는 마우스의 소교세포 역학 및 신경 활동의 동시 이미징과 데이터 처리를 위한 AAV 주사 및 개두술의 프로토콜을 설명합니다. 이 기술은 소교세포 역학과 신경 활동 사이의 조정을 초 미만에서 수십 초에 이르는 시간 척도에서 밝힐 수 있습니다.
수술 프로토콜에는 기술적으로 까다로운 몇 가지 단계가 포함됩니다. AAV 주입은 중요한 단계 중 하나입니다. AAV 주입에 실패하면 R-CaMP의 발현이 크게 감소할 수 있습니다. 두 가지 주요 이유가 있습니다 : 막힌 유리 피펫 및 조직 손상. 유리 피펫의 막힘은 AAV 용액의 배출을 줄이거나 완전히 차단합니다. 이러한 상황은 AAV 용액을 빠른 녹색과 같은 염료로 착색하고 주입 성공을 시각적으로 확인함으로써 피할 수 있습니다. AAV 주사로 인한 조직 손상은 주사 부위의 중심 근처에서 외인성 유전자 발현을 방해합니다. AAV 주입에 의해 유발 된 손상은 피펫 내부의 압력이 축적 된 후 유리 피펫 팁에서 유출이 갑자기 증가하여 발생할 수 있습니다. 따라서 유리 피펫에서 AAV 용액의 유출은 주입 중에 일정해야합니다. 팁에서 직경이 약간 더 넓은 유리 피펫을 선택하면 이 문제를 해결할 수 있습니다. 두개골 창 이식에서는 수술 속도가 중요합니다. 수술이 너무 오래 걸리면 뇌 조직이 심하게 손상될 수 있습니다. 따라서 수술의 속도와 부드러움을 보장하기 위해서는 반복적인 연습이 필요합니다. 또한, 수술부터 영상까지 4주 동안, 종래의 방법(17)에 의해 두개골창과 뇌조직 사이의 조직 재생에 의해 영상의 질이 저하될 수 있다. 이 방법은 조직 재생을 억제하고 창을 깨끗하게 유지하기 위해 두개골 창의 내부 유리 디스크에 두꺼운 유리를 적용하여 이 문제를 극복합니다. 여기에 설명된 시스템에서 이러한 효과는 두께가 0.525 ± 0.075μm인 내부 유리 디스크를 사용하여 분명했습니다.
이 방법은 4 주 이상 된 마우스에 성공적으로 적용 할 수 있지만 어린 마우스에 적용하는 것은 문제가 될 수 있습니다. 어린 생쥐에서 두개골은 빠르고 두드러진 성장을 보여 두개골 뼈와 유리창 사이의 불일치를 유발합니다.
일부 최첨단 연구에서, 생체 내 이광자 이미징은 미세아교세포-뉴런 상호작용을 연구하는 데 사용되었습니다 12,21,23. 특히 Merlini et al.의 선구적인 연구에서, 그들은 세포체 내에서 소교 세포 역학 및 신경 활동의 생체 내 동시 이미징을 수행했습니다21. 이 방법에서는 두개골 창에 더 두꺼운 내부 유리를 사용하여 깊이 방향에서 움직임 인공물을 억제하고 수지상 가시와 같은 미세 구조에서 신경 활동을 안정적으로 측정할 수 있습니다. 이 방법은 깨어 있는 생쥐에서 시냅스-소교세포 과정 상호작용을 조사하는 데 도움이 될 것입니다.
최근, in vitro 연구는 얇은 필로포디아 유사 소교세포 돌기가 두꺼운 돌기보다 더 빠른 운동성을 갖는다는 것을 입증했으며, 이는 감시에서 더 빠른 운동성의 중요성을 시사한다19. 이 시스템은 얇은 미세 아교 세포의 운동성을 1 초 미만에서 수십 초까지의 시간적 해상도로 추적 할 수 있습니다. 이 특성은 생체 내 감시를 위한 운동성의 기능적 중요성을 설명하는 데 도움이 됩니다.
미래에는 이 이미징 기술과 광유전학(optogenetics)24 또는 화학유전학(chemogenetics)25과 같은 개입을 국소 신경 회로 또는 지역 간 신경 연결에 적용하면 신경 회로의 특성을 조각하는 시냅스 발달 및 가소성에서 새로운 소교 기능을 밝힐 수 있을 것입니다. 또한 영상, 개입 및 행동 작업의 추가 통합은 특정 행동의 기초가 되는 미세아교세포와 뉴런의 조정을 밝히는 데 기여할 것입니다.
The authors have nothing to disclose.
바이러스 벡터를 제공해 주신 Masashi Kondo 박사와 Masanori Matsuzaki 박사에게 감사드립니다. 이 연구는 과학 연구 보조금 (20H00481, 20A301, 20H05894, 20H05895 to S.O.), 일본 의학 연구 개발기구 (JP19gm1310003 및 JP17gm5010003 – SO 및 JP19dm0207082 – HM), UTokyo Center for Integrative Science of Human Behavior (CiSHuB), 일본 과학 기술청 Moonshot R &D (JPMJMS2024 – HM), 뇌 과학 재단 (H. M.에게).
10-inch LCD monitor | EIZO | DuraVision FDX1003 | For presenting grating visual stimuli |
26G Hamilton syringe | Hamilton | 701N | |
27G needle | Terumo | NN-2719S | |
AAV-hSyn-R-CAMP1.07 | N/A | N/A | Kindly gifted from Prof. Matsuzaki's laboratory |
Activated charcoal powder | Nacalai tesque | 07909-65 | |
Black aluminum foil | THORLABS | BKF12 | |
CX3CR1-EGFP mouse | Jackson laboratory | IMSR_JAX: 005582 | CX3CR-1EGFP/+ knock-in/knock-out mice expressing EGFP in microglia in the brain under the control of the endogenous Cx3cr1 locus. |
DENT SILICONE-V | Shofu Inc | N/A | For the attachment of a shading device to a head-plate |
Dental cement (quick resin, liquid) | Shofu Inc | N/A | AB |
Dental cement(quick resin, powder) | Shofu Inc | N/A | B Color 3 |
Drill | Toyo Associates | HP-200 | |
Glass capillary pipette | Drummond Scientific Company | 2-000-075 | |
Glass disc (large) | Matsunami | N/A | 4mm in diameter, 0.15±0.02mm in thickness |
Glass disc (small) | Matsunami | N/A | 2mm in diameter, 0.525±0.075mm in thickness |
Head-plate | Customized | N/A | Material: SUS304, thickness: 0.5mm, see Figure2B for the shape |
Hemostatic fiber | Davol Inc | 1010090 | |
ImageJ Fiji software | Free software | For data registration | |
Instant glue (Aron alpha) | Daiichi Sankyo | N/A | |
Isoflurane | Pfizer | N/A | |
Lidocaine | Astrazeneca | N/A | |
MATLAB 2017b | MathWorks | N/A | For data registration and processing |
Meloxicam | Tokyo Chemical Industry | M1959 | |
Microinjector | KD scienfitic | KDS-100 | |
Micropipette puller | Sutter Instrument Company | P-97 | |
Multi-photon excitation microscope | NIKON | N/A | The commercial name is "A1MP+". |
Objective lens | NIKON | N/A | The commercial name is "CFI75 apochromat 25xC W". |
Paraffin Liquid | Nacalai tesque | 26132-35 | |
Psychtoolbox | Free software | For presenting grating visual stimuli | |
Shading device | Customized | N/A | |
Stereomicroscope | Leica | M165 FC | |
Stereotaxic instrument | Narishige Scientific Instrument | SR-611 | For the surgery |
Stereotaxic instrument | Customized | N/A | For fixing mice under the two-photon microscope |
Stopcock | ISIS | VXB1079 | |
Surgical silk | Ethicon | K881H | |
Treadmill | Customized | N/A | |
UV light curing agent | Norland Products Inc | NOA 65 | |
Vaporizer | Penlon | Sigma Delta | Anesthetic machine |