在这里,我们描述了一种将腺相关病毒注射与颅窗植入相结合的方案,用于同时对清醒小鼠的小胶质细胞动力学和神经元活动进行成像。
由于大脑功能受到来自外周组织的信号的持续影响,因此阐明大脑中的神经胶质细胞如何感知外周的各种生物条件并将信号传递给神经元至关重要。小胶质细胞是大脑中的免疫细胞,参与突触发育和可塑性。因此,小胶质细胞对响应身体内部状态的神经回路构建的贡献应通过小胶质细胞动力学与神经元活动之间关系的活体成像来批判性地测试。
在这里,我们描述了一种在清醒小鼠中同时成像小胶质细胞动力学和神经元活动的技术。将编码R-CaMP的腺相关病毒(红色荧光蛋白的基因编码钙指示剂)注射到在小胶质细胞中表达EGFP的CX3CR1-EGFP转基因小鼠初级视觉皮层的第2/3层中。病毒注射后,在注射区域的脑表面上安装了一个颅窗。手术后4周清醒小鼠 体内双光 子成像表明,神经活动和小胶质细胞动力学可以同时以亚秒级时间分辨率记录。该技术可以揭示小胶质细胞动力学与神经元活动之间的协调,前者对外周免疫状态作出反应,后者编码内部大脑状态。
越来越多的证据表明,身体的内部状态不断影响动物的大脑功能1,2,3,4,5。因此,为了更深入地了解大脑功能,阐明大脑中的神经胶质细胞如何监测外围的生物条件并将信息传递给神经元至关重要。
小胶质细胞是大脑中的免疫细胞,参与突触发育和可塑性,其塑造大脑中神经回路的特征6,7,8,9。例如,Wake等人的开创性工作表明,小胶质细胞过程在小鼠新皮层中以神经元活动依赖性方式与突触接触,并且人工缺血在与小胶质细胞长时间接触后诱导突触丢失10。Tremblay等人发现,视觉体验的改变改变了小胶质细胞与突触相互作用的方式。在初级视觉皮层(V1)的树突棘周转因双眼剥夺而增加的关键时期,暗适应会降低小胶质细胞突的运动性,并增加它们与突触裂隙的接触频率和小胶质细胞中细胞包涵体的数量11。这些结果表明,小胶质细胞过程感知神经活动及其周围环境以重塑神经回路。此外,最近的一项研究报告说,清醒和麻醉条件下的小胶质细胞监测不同,这表明使用清醒小鼠进行实验在生理条件下研究神经元 – 小胶质细胞通信的重要性12。
体内双光子钙成像是记录钙动力学的有力工具,反映了活体动物中数百个神经元的持续神经元放电13,14,15。神经元中的钙成像通常需要超过几赫兹的时间分辨率来跟踪快速神经元反应16,17。相比之下,先前跟踪小胶质细胞动力学的研究以小于0.1 Hz的相对较低的时间分辨率对小胶质细胞结构进行了采样18,19,20。最近的一项研究应用同步双光子成像来了解神经元-小胶质细胞的通信21。然而,目前尚不清楚动态小胶质细胞过程如何在清醒小鼠中以超过几赫兹的时间分辨率响应周围的神经活动。为了解决这个问题,我们描述了一种在清醒小鼠中具有高于1Hz的时间分辨率的神经活动和小胶质细胞动力学的同步体内双光子成像方法。该方法使我们能够以更高的帧速率(最大,30 Hz,像素帧大小为512 x 512像素)在清醒小鼠中实现稳定的成像,并为研究小胶质细胞的监视行为或其与清醒小鼠神经元活动的相互作用提供了更有利的方法。
我们描述了AAV注射和开颅术的方案,用于同时对清醒小鼠的小胶质细胞动力学和神经元活动进行成像以及数据处理。该技术可以在亚秒到几十秒的时间尺度上揭示小胶质细胞动力学与神经元活动之间的协调。
手术方案涉及几个技术要求苛刻的步骤。AAV注射是关键步骤之一。不成功的AAV注射可能导致R-CaMP表达的显着降低。主要有两个原因:玻璃移液器堵塞和组织损伤。玻璃移液器的堵塞可减少或完全阻止AAV溶液的喷射。这种情况可以通过用诸如快绿之类的染料对AAV溶液进行着色并目视确认注射成功来避免。AAV注射引起的组织损伤会阻止注射部位中心附近的外源性基因表达。AAV注射引起的损伤很可能是由于移液器内部压力积聚后玻璃移液器尖端的外排量突然增加引起的。因此,AAV溶液从玻璃移液管流出在注射过程中应该是恒定的。选择尖端直径稍宽的玻璃移液器可以解决这个问题。在颅窗植入术中,手术速度至关重要。如果手术时间过长,脑组织可能会严重受损。因此,需要反复练习以确保手术的速度和顺利。此外,在从手术到成像的4周内,通过常规方法17,颅窗和脑组织之间的组织再生可能会降低成像质量。这里的方法通过在颅窗的内玻璃盘上应用厚玻璃来克服这个问题,以抑制组织再生并保持窗户清洁。在这里描述的系统中,通过使用厚度为0.525±0.075μm的内玻璃盘,这种效果很明显。
该方法可以成功地应用于4周以上的小鼠,但应用于年轻小鼠可能有问题。在幼年小鼠中,头骨显示出快速而突出的生长,这导致颅骨和玻璃窗之间的不匹配。
在一些前沿研究中,体内双光子成像用于研究小胶质细胞-神经元相互作用12,21,23。特别是在Merlini等人的开创性工作中,他们同时对细胞体内的小胶质细胞动力学和神经活动进行了体内成像21。在这种方法中,通过使用较厚的内玻璃作为颅窗,我们可以抑制深度方向上的运动伪影,并实现对微结构(如树突棘)中神经元活动的稳定测量。该方法将有助于研究清醒小鼠的突触 – 小胶质细胞过程相互作用。
最近, 体外 研究表明,薄丝足样小胶质细胞突比厚突具有更快的运动性,这表明它们在监测中更快运动的重要性19。这里的系统可以跟踪薄小胶质细胞过程的运动性,时间分辨率从亚秒到几十秒不等。该特性有助于阐明其运动性对 体内监测的功能意义。
将来,将这种成像技术与应用于局部神经回路或区域间神经连接的干预措施(例如光遗传学24 或化学遗传学25)相结合,将揭示突触发育和可塑性中的新型小胶质细胞功能,从而塑造神经回路的特征。此外,成像、干预和行为任务的进一步整合将有助于揭示小胶质细胞和特定行为神经元的协调。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢Masashi Kondo博士和Masanori Matsuzaki博士提供病毒载体。这项工作得到了科学研究补助金(20H00481,20A301,20H05894,20H05895至S.O.),日本医学研究与发展机构(JP19gm1310003和JP17gm5010003至S.O.和JP19dm0207082至H.M.),东京大学人类行为综合科学中心(CiSHuB),日本科学技术振兴机构登月研发(JPMJMS2024至H.M.)的支持, 脑科学基金会(致H.
10-inch LCD monitor | EIZO | DuraVision FDX1003 | For presenting grating visual stimuli |
26G Hamilton syringe | Hamilton | 701N | |
27G needle | Terumo | NN-2719S | |
AAV-hSyn-R-CAMP1.07 | N/A | N/A | Kindly gifted from Prof. Matsuzaki's laboratory |
Activated charcoal powder | Nacalai tesque | 07909-65 | |
Black aluminum foil | THORLABS | BKF12 | |
CX3CR1-EGFP mouse | Jackson laboratory | IMSR_JAX: 005582 | CX3CR-1EGFP/+ knock-in/knock-out mice expressing EGFP in microglia in the brain under the control of the endogenous Cx3cr1 locus. |
DENT SILICONE-V | Shofu Inc | N/A | For the attachment of a shading device to a head-plate |
Dental cement (quick resin, liquid) | Shofu Inc | N/A | AB |
Dental cement(quick resin, powder) | Shofu Inc | N/A | B Color 3 |
Drill | Toyo Associates | HP-200 | |
Glass capillary pipette | Drummond Scientific Company | 2-000-075 | |
Glass disc (large) | Matsunami | N/A | 4mm in diameter, 0.15±0.02mm in thickness |
Glass disc (small) | Matsunami | N/A | 2mm in diameter, 0.525±0.075mm in thickness |
Head-plate | Customized | N/A | Material: SUS304, thickness: 0.5mm, see Figure2B for the shape |
Hemostatic fiber | Davol Inc | 1010090 | |
ImageJ Fiji software | Free software | For data registration | |
Instant glue (Aron alpha) | Daiichi Sankyo | N/A | |
Isoflurane | Pfizer | N/A | |
Lidocaine | Astrazeneca | N/A | |
MATLAB 2017b | MathWorks | N/A | For data registration and processing |
Meloxicam | Tokyo Chemical Industry | M1959 | |
Microinjector | KD scienfitic | KDS-100 | |
Micropipette puller | Sutter Instrument Company | P-97 | |
Multi-photon excitation microscope | NIKON | N/A | The commercial name is "A1MP+". |
Objective lens | NIKON | N/A | The commercial name is "CFI75 apochromat 25xC W". |
Paraffin Liquid | Nacalai tesque | 26132-35 | |
Psychtoolbox | Free software | For presenting grating visual stimuli | |
Shading device | Customized | N/A | |
Stereomicroscope | Leica | M165 FC | |
Stereotaxic instrument | Narishige Scientific Instrument | SR-611 | For the surgery |
Stereotaxic instrument | Customized | N/A | For fixing mice under the two-photon microscope |
Stopcock | ISIS | VXB1079 | |
Surgical silk | Ethicon | K881H | |
Treadmill | Customized | N/A | |
UV light curing agent | Norland Products Inc | NOA 65 | |
Vaporizer | Penlon | Sigma Delta | Anesthetic machine |