Imágenes simultáneas de la dinámica microglial y la actividad neuronal en ratones despiertos

Todos los experimentos fueron aprobados por el Comité de Ética Animal y el Comité de Seguridad de Experimentos Recombinantes Genéticos de la Escuela de Graduados de Medicina y la Facultad de Medicina de la Universidad de Tokio, y se realizaron de acuerdo con sus directrices. 1. Preparación Esterilizar todos los instrumentos y aparatos necesarios para la cirugía utilizando autoclave o etanol al 70%. Preparación de pipetas de vidrio.Fije firmemente un capilar calibrado de 75 μL al soporte del extractor de micropipetas. Ajuste el extractor al programa con los parámetros recomendados como P (presión) = 500, CALOR = 680, EXTRACCIÓN = 30, VEL = 60, TIEMPO = 180. Después de terminar el programa (generalmente 4.5 a 5 s), el capilar se divide en dos pipetas de vidrio con colas estrechas. Luego, rompa la parte distal de las colas con pinzas para mantener el diámetro de la punta dentro de 30-50 μm. Para ello, rompe las colas 1 cm distales hasta el final de la parte biselada. Para la craneotomía, prepare una ventana craneal pegando un disco de vidrio exterior más grande, de 4 mm de diámetro, 0.15 ± 0.02 mm de espesor, a un disco de vidrio interno más pequeño, de 2 mm de diámetro, 0.525 ± 0.075 mm de espesor, utilizando un reactivo de curado por luz UV (Figura 2A). 2. Inyección de AAV Preparación del aparato de inyecciónColoque una pipeta de vidrio conectada a una jeringa Hamilton de 26 G a través de un tubo sobre un soporte de pipeta de un instrumento estereotáxico y, a continuación, incline el soporte para pipeta 60° anteriormente desde el eje vertical (Figura 1A, B). Llene la pipeta de vidrio, la jeringa y el tubo de conexión con parafina líquida. Coloque la jeringa en un microinyector. Procedimiento quirúrgicoNOTA: La siguiente cirugía se realizó en una cabina esterilizada. Se utilizó un microscopio estereoscópico para la cirugía si era necesario.Anestesiar un ratón CX3CR1-EGFP macho (información detallada en la Tabla de materiales) a las 7 a 8 semanas de edad (peso corporal 22-26 g) con isoflurano al 3% en una cámara estanca al gas. Después de 3 minutos, saque al ratón de la cámara cuando pierda el movimiento voluntario, excepto la respiración, y luego cambie a anestesia continua mediante un tubo nasal con isoflurano al 2%.NOTA: Se sabe que el isoflurano activa la microglía. Sin embargo, debido a que las imágenes se realizan 4 semanas después de la cirugía, no hay efecto del isoflurano en los ratones durante la obtención de imágenes. Aunque la anestesia con isoflurano se utiliza durante unos minutos cuando los ratones se colocan en el instrumento estereotáxico antes de la obtención de imágenes (paso 4.2.1), encontramos que el efecto de esta anestesia corta es insignificante. Durante la cirugía, mantenga el ratón caliente con una almohadilla térmica a 37 °C para evitar la hipotermia. Aplicar ungüento ocular en ambos ojos para prevenir la sequedad corneal y administrar una inyección de meloxicam, por vía subcutánea (5 mg/kg). Conecte el ratón a una barra auxiliar y, a continuación, fije el ratón en el instrumento estereotáxico con el lado dorsal hacia arriba. Ajuste la concentración de isoflurano a un porcentaje apropiado (1% -2%) durante la cirugía mientras monitorea la respiración y la frecuencia cardíaca. Retire el vello con crema depilatoria y desinfecte la cabeza varias veces con un exfoliante a base de yodo o clorhexidina y alcohol. Luego, inyecte 0.1 ml de lidocaína al 1% por vía subcutánea y aplique cortinas estériles para asegurar el sitio quirúrgico. Abra el cuero cabelludo a lo largo de la línea media con tijeras y haga la incisión de unos 2 cm de largo, para garantizar una buena exposición del cráneo por encima de la corteza visual primaria derecha. Después de la incisión del cuero cabelludo, irrigar la cabeza con solución salina durante todo el procedimiento para evitar que el cráneo y el cerebro expuestos se sequen. Retire el periostio del cráneo expuesto con fórceps. Perfore el cráneo en las coordenadas estereotáxicas: 3 mm lateral a la línea media, 0,5 mm anterior a la línea lambda, para crear un pequeño agujero con aproximadamente 0,5 mm de diámetro. Enjuague la sangre y los restos de tejido de la broca, si es necesario. Llenar la pipeta de vidrio con 1 μL de rAAV2/1-hSyn-R-CaMP1.07 utilizando el siguiente procedimiento a un título de 8,3 x 1012 genomas vectoriales/ml22.Avance la jeringa para expulsar 1 μL de parafina líquida de la pipeta de vidrio. Coloque un trozo de película transparente, de aproximadamente 2 cm x 2 cm, sobre el cráneo expuesto del ratón y expulse una gota de 1 μL de solución AAV sobre la película utilizando un pipete. Coloque la punta de la pipeta de vidrio en la gota de solución AAV en la película y tire suavemente de la jeringa para aspirar la solución AAV. Después de la eyección, gire la llave de paso en forma de T para liberar la presión dentro del tubo y la pipeta de vidrio. Inserte la pipeta de vidrio a una profundidad de 500 μm desde la superficie cerebral a través del orificio creado en el paso 2.2.5 y, a continuación, inyecte 0,5 μL de solución de AAV utilizando el microinyector (figura 1C). Utilizar el caudal volumétrico de inyección de 2,0 μL/h; una inyección de 0,5 μL dura 15 min, y luego esperar 5 min. Después de la inyección, retire suavemente la pipeta de vidrio y enjuague la superficie cerebral con solución salina. 3. Implantación de ventana craneal NOTA: La implantación de ventana craneal sigue a la inyección de AAV el mismo día. Marque un círculo de 2,5 mm de diámetro en el cráneo, centrado 3 mm lateralmente de la lambda. Cree una ranura circular a lo largo de la marca en el cráneo perforando. Limpie los residuos, ya que pueden afectar negativamente la visibilidad del cráneo y aplique solución salina durante el proceso de perforación para evitar el calentamiento. Para verificar si la profundidad de perforación en la ranura circular es suficiente para eliminar el fragmento central del cráneo, presione suavemente el cráneo central con fórceps. Si se mueve verticalmente con poca resistencia, la profundidad de perforación es suficiente. Cuando el surco alcance suficiente profundidad, inserte la punta de los fórceps en la parte inferior del fragmento central del cráneo y levántelo y retírelo suavemente para exponer la superficie del cerebro (Figura 1D). Con una aguja de 27 G, pinche y rasgue la duramadre en el borde de la superficie cerebral expuesta. Inserte la punta de los fórceps a través del orificio hecho en el borde de la duramadre. Sostenga la duramadre y despéguela para exponer la superficie del cerebro.NOTA: Si se produce sangrado, enjuague la superficie del cerebro con solución salina hasta que el sangrado se detenga. Usando fórceps, disperse las fibras hemostáticas una por una en solución salina en un plato de 3,5 mm y luego coloque las fibras hemostáticas a lo largo de los márgenes del orificio en el que está presente la duramadre transectada. Coloque una ventana craneal preparada en el paso 1.3 en la superficie cerebral expuesta y luego adhiérala al cráneo con pegamento instantáneo mientras presiona suavemente la ventana para que la ventana esté en contacto cercano con el cráneo. Luego, aplique pegamento instantáneo a todo el cráneo expuesto y luego coloque cuidadosamente una placa de cabeza en el cráneo para que la ventana se ubique en el centro del orificio cuadrado de la placa de cabeza (Figura 2C). Asegúrese de que la superficie de la placa principal sea paralela a la superficie de la ventana de vidrio. Después de que el pegamento se haya endurecido lo suficiente, aplique cemento dental en el cráneo expuesto para reforzar la unión entre la cabeza y la placa de la cabeza (Figura 2).NOTA: Si los experimentos incluyen la presentación de estímulos visuales a ratones, se debe evitar la luz parásita en el área de imágenes. Es recomendable ennegrecer el cemento mezclándolo con el carbón activado para la reducción de la reflexión de la luz. Retire el ratón de la anestesia después de que el cemento se haya endurecido lo suficiente (aproximadamente 20 minutos). Luego, coloque al ratón en una nueva jaula para recuperarse solo. Después de confirmar su conciencia y movimiento voluntario, lo que indica una recuperación completa, vuelva a colocar el mouse en la jaula de la casa. Durante la recuperación, administre una segunda dosis, o más si es necesario, de meloxicam (una vez cada 24 horas durante 1-3 días) si se producen comportamientos obvios que indican dolor. 4. Imágenes in vivo de dos fotones de la microglía y la dinámica neuronal del calcio Habituación de ratones al aparato microscópicoTres semanas después de la cirugía, inducir anestesia en el ratón con isoflurano al 3% y colocar el ratón bajo la lente objetivo 25x de un microscopio de dos fotones utilizando un instrumento estereotáxico hecho a medida (Figura 3C). Para la configuración aquí, el mouse se coloca en la parte superior de una cinta de correr y se le permite funcionar libremente. Aproximadamente 10 minutos después, retire el mouse de la etapa de microscopio y devuélvalo a la jaula de la casa. Repita la habituación al menos 3 veces cada día alterno antes de la adquisición de imágenes de dos fotones. Adquisición de imágenes de dos fotonesNOTA: Recomendamos realizar la adquisición de imágenes más de 4 semanas después de la cirugía, ya que la activación microglial regresa gradualmente al nivel basal.Como en el paso 4.1, inducir la anestesia en el ratón con isoflurano al 3% y colocar el ratón bajo la lente objetiva del microscopio de dos fotones utilizando un instrumento estereotáxico hecho a medida. Instale el dispositivo de sombreado hecho a medida y un monitor LCD para la estimulación visual como se describe a continuación (Figura 3D).Coloque la lente para enfocar la superficie del cerebro y, a continuación, establezca esta posición de la lente como la posición Z original. Mantenga constantes las coordenadas x-y y eleve la lente del objetivo; Retire el ratón y el instrumento estereotáxico de la lente del objetivo y de la cinta de correr. Coloque un dispositivo de sombreado en la parte superior de la placa principal con silicona, que se ennegrece mezclándola con polvo de carbón, y asegúrese de que el espacio entre la placa principal y el dispositivo de sombreado esté bien sellado. Llene el dispositivo de sombreado con agua destilada y luego fije el mouse y el marco estereotáxico nuevamente debajo del objetivo y en la cinta de correr. Restablezca cuidadosamente el plano focal en la superficie del cerebro, verificando la profundidad de la lente del objetivo.NOTA: Para evitar el riesgo de dañar la lente del objetivo, establezca primero las coordenadas xyz y, a continuación, aplique el dispositivo de sombreado de la lente del objetivo. También es razonable instalar primero la cubierta y luego ajustar las coordenadas, pero es necesario un manejo cauteloso para esta opción. Cubra la lente del objetivo con papel de aluminio negro para evitar la contaminación lumínica del monitor LCD utilizado para la estimulación visual a través de la lente del objetivo (Figura 3D). Coloque un monitor LCD de 10 pulgadas a 12,5 cm delante de los ojos del ratón para presentar estímulos visuales (Figura 3D). Configure los filtros de recolección de emisiones de fluorescencia para fluorescencia EGFP (filtro de emisión 525/50 nm) y fluorescencia R-CaMP (filtro de emisión 593/46 nm) y la longitud de onda de excitación hasta 1.000 nm. Adquiera imágenes con una resolución espacial de 0,25 μm/píxel utilizando un objetivo de 25x 1,1 NA y PMT GaAsP. Encuentre la región de imagen en la que las neuronas R-CaMP (+) y la microglía EGFP (+) se pueden visualizar simultáneamente en la capa 2/3. Para esta configuración, los datos obtenidos en la Figura 4 y el Video 1 estaban a una profundidad de 100 μm desde la superficie pial, utilizando una vista previa de imagen en vivo. Mantenga la potencia del láser de excitación lo más baja posible para evitar el fotoblanqueo y el daño causado por el aumento de la temperatura local en la región de imágenes. Adquiera imágenes a la velocidad de fotogramas de 30 Hz. Simultáneamente con la adquisición de la imagen, presente un estímulo visual de deriva a 100% de contraste, 1.5 Hz, 0.04 ciclos por grado en 12 direcciones a 6 orientaciones de 0° a 150° en pasos de 30° al mouse17. Después de la adquisición de la imagen, retire el mouse de la etapa de microscopio, separe el dispositivo de sombreado y el instrumento estereotáxico del mouse y devuelva el mouse a su jaula doméstica. Registro de datosConvierta y guarde los datos de imagen adquiridos (formato nd2 en este caso) como una serie de archivos de imagen tiff para cada canal de color, utilizando Fiji o el software suministrado con el microscopio. Aplique Turboreg, un complemento de Fiji, para realizar el registro con modo = traducción. Utilice la imagen promediada como imagen de referencia con los archivos de imagen tiff del canal EGFP. Realice el siguiente procesamiento para cada fotograma con MATLAB.NOTA: Aunque MATLAB se utiliza en el siguiente procesamiento, la descripción se centra principalmente en la intención de cada paso para que los datos puedan ser analizados por otro software de programación como Python.Utilice la función imread para leer dos imágenes tiff EGFP antes y después del registro del mismo fotograma, respectivamente. Utilice la función imread para leer la imagen tiff R-CaMP del mismo fotograma. Utilice la función normcorr2 para calcular la función de correlación entre las variables vectorizadas de las dos imágenes GFP leídas en el paso 4.3.3.1. Utilice la función max para detectar el índice lineal con la correlación cruzada más alta de la función de correlación y, a continuación, utilice la función ind2sub para calcular la posición de movimiento de la imagen registrada a partir de su imagen original. Utilice la función imwarp para traducir la imagen R-CaMP a la posición calculada en el paso 4.3.3.3 y, a continuación, utilice la función imwrite para guardar la imagen registrada de R-CaMP. Generación de trazas de calcioRealice el siguiente procesamiento con MATLAB. Utilice la función imread para leer todas las imágenes tiff R-CaMP registradas generadas en el paso 4.3.3.4. Si las imágenes registradas ya se han cargado como una variable en el espacio de trabajo, omita este paso. Utilice la función media para generar una imagen de proyección temporal. Utilice la función imshow para mostrar la imagen promediada como una figura; Utilice la función ROIPOLY para generar una máscara de ROI binaria de la estructura objetivo (columna dendrítica en estos datos). Usando la función media con las imágenes obtenidas multiplicando la máscara binaria con imágenes de cada fotograma como variables de entrada, calcule la intensidad de fluorescencia promediada dentro del ROI para cada fotograma. Como se describió anteriormente17, a la variable obtenida en el paso 4.4.3, aplique el filtro de frecuencia de valor de mantequilla en el corte = 1.6 s, para cortar el ruido de alta frecuencia, y luego aplique el filtro mediano deslizante en la ventana de tiempo = 200 s, para cortar el ruido de baja frecuencia.