이 논문은 정밀하게 제어된 수술과 이광자 현미경을 사용하여 마우스 해마 CA1에서 휴식 미세아교세포를 만성적으로 생체 내에서 관찰하는 방법을 설명합니다.
뇌에 존재하는 유일한 면역 세포인 미세아교세포는 시냅스와 신경 흥분성을 수정하여 신경 회로 유지에 적극적으로 참여합니다. 최근 연구에 따르면 서로 다른 뇌 영역에서 미세아교세포의 차등 유전자 발현과 기능적 이질성이 밝혀졌습니다. 학습과 기억에서 해마 신경망의 독특한 기능은 시냅스 리모델링에서 미세아교세포의 활성 역할과 관련될 수 있습니다. 그러나 외과적 시술에 의해 유도된 염증 반응은 해마 미세아교세포의 이광자 현미경 분석에서 문제가 되었습니다. 여기에서는 이미징 창을 통해 해마 CA1의 모든 층에서 미세아교세포를 만성적으로 관찰할 수 있는 방법이 제시됩니다. 이 방법을 사용하면 1 개월 이상 소교 세포의 형태 학적 변화를 분석 할 수 있습니다. 휴지기 미세아교세포의 장기 고해상도 이미징에는 최소 침습 수술 절차, 적절한 대물 렌즈 선택 및 최적화된 이미징 기술이 필요합니다. 해마 미세아교세포의 일시적인 염증 반응은 수술 직후 영상을 방해할 수 있지만 미세아교세포는 몇 주 이내에 정지 형태를 회복합니다. 또한 미세아교세포와 동시에 뉴런을 이미징하면 해마에서 여러 세포 유형의 상호 작용을 분석할 수 있습니다. 이 기술은 해마의 소교세포 기능에 대한 필수 정보를 제공할 수 있습니다.
Microglia는 뇌에 존재하는 유일한 면역 세포와 조직 대 식세포입니다. 염증에 대한 신속한 반응과 같은 면역 세포로서의 기능 외에도 시냅스 가지치기, 시냅스 가소성 조절, 신경 활동 조절과 같은 신경 회로의 유지 및 리모델링에 다양한 생리학적 역할을 하는 것으로 나타났습니다 1,2,3,4,5 . 미세아교세포와 뉴런 사이의 생리학적 상호작용은 신경 회로 발달과 질병 신경생물학 모두에서 점점 더 많은 관심을 받고 있습니다. 생체 내에서 미세아교세포의 생리를 분석하기 위해서는 조직 손상 및 염증 반응 없이 미세아교세포를 관찰할 수 있는 방법이 필요하다. 그러나 미세아교세포는 염증에 민감하며 조직 손상에 반응하여 모양과 기능을 극적으로 변화시킵니다 6,7.
이광자 생체 내 이미징은 미세아교세포의 생리학적 역학을 포착하기 위한 이상적인 도구이다8. 생체 내 이광자 이미징의 초기 적용은 성인 마우스 피질에서 환경 감시를 위한 소교세포 과정의 동적 움직임을 밝혀냈습니다 9,10. 다음의 이광자 이미징 연구는 뉴런과의 기능적 및 구조적 상호작용 분석을 위해 미세아교세포의 생체 내 모니터링을 추가로 확장했습니다 5,11,12,13,14. 그러나, 종래의 이광자 현미경의 이미징 깊이는 뇌 표면으로부터 1 mm 미만으로 제한되었다(15,16). 이 제약은 해마와 같은 심부 뇌 영역에서 미세아교세포의 행동을 보고한 이전 연구의 부족을 설명합니다.
최근의 RNA 시퀀싱 연구는 미세아교세포의 상당한 지역적 이질성을 밝혀냈고, 뚜렷한 기능적 역할의 가능성을 높였다 17,18,19,20,21. 따라서 다양한 뇌 영역의 뉴런과의 소교세포 상호작용을 기록할 필요가 있지만 기술적인 어려움으로 인해 이러한 연구가 방해를 받고 있습니다. 특히, 시냅스 리모델링에 소교세포의 적극적인 관여는 해마 신경망과 그 기억 관련 기능의 발달에 중요한 것으로 보고되었습니다22,23. 그러나 생체 내에서 도전받지 않은 해마 미세아교세포를 관찰하기 위한 효과적인 방법은 없었습니다.
이 프로토콜은 정밀하게 제어된 수술 기술을 사용하여 등쪽 해마의 CA1에서 휴식 미세아교세포의 만성 생체 내 관찰 절차를 설명합니다. 미세아교세포에서 GFP를 발현하는 CX3CR1-GFP 마우스(CX3CR1+/GFP)의 CA1 영역의 이광자 이미징24는 충분한 분해능으로 CA1의 모든 층에서 분급된 미세아교세포를 관찰할 수 있게 했습니다. 이 프로토콜에는 관찰 창과 적절한 이미징 조건의 성공적인 이식을 위한 몇 가지 팁이 포함되어 있습니다. 또한, CA1에서 피라미드 뉴런과 미세아교세포의 동시 시각화가 응용 사례로 제시됩니다. 이 기술의 장점, 한계 및 잠재력에 대해서도 설명합니다.
이 방법에는 정교한 수술 절차가 포함되어 있지만 적절하게 준비하면 오랜 기간 동안 전체 CA1에 걸쳐 고해상도 이미지를 제공할 수 있습니다. 여러 생쥐를 대상으로 한 실험에서 만성 수술 후 단계의 이미지 품질이 급성 수술 후 영상보다 우수하다는 것이 확인되었습니다. 더 나은 이미지 품질은 2 개월 이상 유지되었습니다. 실패의 가장 흔한 원인은 수술 중 CA1의 의도하지 않은 손상이며, 이는 수술 후 품질 검사에서 확인됩니다(4단계 참조). 이것은 흡인에 의한 직접적인 손상, 뇌의 건조, 유리에 의한 과도한 압력 또는 최종 단계에서 치과용 시멘트의 독성 때문일 수 있습니다. 실패의 또 다른 원인은 수술 후 출혈이며, 수술 후 1 주일 이내에 유리 바닥 창을 통해 확인할 수 있습니다 (6.1 단계 참조). 프로토콜을 주의 깊게 읽고 이러한 문제를 피하기 위해 모든 예방 조치를 취하십시오.
현재 실험실에서 GaAsP 검출기를 사용하는 이광자 현미경을 설정하더라도 피질을 통해 등쪽 CA1을 이미지화하려는 시도는 무시할 수 없는 빛의 산란으로 인해 해상도가 크게 손실됩니다. 따라서, CA1에서 소교 세포의 움직임 또는 뉴런의 수지상 가시의 형성을 관찰하기에 충분한 해상도를 얻기 위해, 본 방법에서와 같이 위에 놓인 피질의 일부를 제거하는 것이 불가피하다. 높은 이미지 해상도를 유지하면서 피질 제거 정도를 줄이는 유일한 대안은 GRIN(Gradient Refractive Index) 렌즈와 같은 릴레이 렌즈를 내장하는 것입니다. 이 접근법에서, GRIN 렌즈는 만성 CA1 이미징28,29을 위해 CA1 바로 위에 이식된 가이드 튜브 내부에 배치되었습니다. 가이드 튜브의 외경은 1.8mm로 본 논문의 3.0mm보다 작으면서도 여기 시스템에 필적하는 고해상도(NA; 0.82)를 생성했습니다(유효 NA; 0.88). 그러나 GRIN 렌즈를 사용한 접근 방식은 고해상도 관찰을 위한 좁은 시야와 GRIN 렌즈의 WD에 의해 제한되는 짧은 이미징 깊이를 가지고 있습니다. 따라서 넓은 시야에서 모든 해마층을 고해상도로 이미징하는 것이 이 논문의 방법의 구체적인 장점입니다.
이 절차의 한계는 피질과 염증의 부분적 제거가 해마에 해로운 영향을 미칠 수 있다는 것입니다. 그러나 제거 된 피질은 해마에 직접적인 입력이 없기 때문에 내후각 피질이 손상되지 않고 해마 자체가 직접 손상되지 않기 때문에 전반적인 평가는 해마의 기능 손상이 크지 않다는 것입니다. 이전의 여러 연구에서 학습과 기억을 포함한 해마 기능이 해마 창 이식 후 보존된다는 것이 확인되었습니다 25,26,27,30,31,32,33,34. 따라서 여기에 설명된 이미징 접근법은 수술 후 충분한 기간 후에 해마 기능을 충실하게 보고할 것으로 예상됩니다.
이 영상화 기법을 기반으로 한 연구 대상의 향후 방향에는 미세아교세포와 뉴런의 동시 영상화에 의해 검출되는 시냅스 가지치기(synaptic pruning)5, 시냅스(synapses)와 학습과 관련된 소교세포(microglial interaction)35, 해마(hippocampal) 신경활동(hippocampal neural activity)36에 의해 조절되는 소교세포 운동성(microglial motility)36, 말초 염증 또는 조직 손상에 대한 소교세포반응(microglial responses to peripheral inflammation to peripheral retins)7 등이 있다. 이 방법은 또한 신경 퇴행성 질환의 진행을 밝히는 데 도움이 될 것입니다. 예를 들어, 알츠하이머 병 (AD)에서 아밀로이드 β 및 타우 단백질은 신경 세포 사멸 및 해마 위축과 병행하여 축적되어인지 기능 장애를 유발합니다. 미세아교세포는 이 과정에 관여하는 것으로 보고되었다37,38. AD 마우스 모델을 사용한 미세아교세포 및 뉴런의 생체 내 만성 이미징을 통해 AD 마우스 모델의 해마에서 소교세포 기능과 뉴런 병리 사이의 상관관계를 모니터링할 수 있습니다.
이 논문은 소교세포 이미징에 초점을 맞추고 있지만 동일한 이미징 절차가 CA1의 다른 신경 및 신경교 세포 유형에도 적용됩니다. 또한, 프로토콜은 마취된 마우스의 이미징으로 제한되지만, 이 기술은 깨어 있는 마우스에서 해마 미세아교세포를 모니터링하는 데까지 확장될 수도 있습니다. 호흡, 심장 박동 및 신체 움직임에 의해 유도 된 운동 인공물, 특히 유리창에서 멀리 떨어진 깊은 해마 층에서 깨어있는 쥐를 대상으로 한 실험에 존재할 수 있습니다. 따라서 소교세포의 형태와 역학을 포착하기 위해 적절한 동작 보정 시스템이 필요할 수 있습니다.
의정서 관련 논의
시간적 및 공간적 특이성을 갖는 형광 프로브의 발현을 위해 적절한 연령과 유전자 변형을 가진 마우스를 선택하는 것이 좋습니다 (1.3 단계 참조). 생후 1개월의 마우스는 실험에 사용할 수 있지만 2개월 이상 된 마우스는 몸집이 크고 수술 스트레스에 대한 저항력이 있어 다루기가 더 쉽습니다. 또한, 외부 캡슐과 해마의 폐포는 어린 생쥐에서 분리하기가 더 어렵습니다. 따라서 어린 생쥐에서 외부 캡슐을 제거하려면 수술 기술이 필요합니다 (3.4.3-4 단계 참조). 수술 및 후속 이미징의 평가는 CA1 및 DG에서 형광 단백질을 재현 가능하고 균일하게 발현하는 마우스로 더 간단할 것입니다(4.7단계 참조). 따라서, 수술의 초기 시험에서, Thy1-YFP 또는 Thy1-GFP 마우스(39)와 같이 드물게 표지된 뉴런을 가진 형질전환 마우스를 사용하는 것이 바람직하며, CX3CR1-GFP 마우스(24)와 같이 표지된 미세아교세포를 갖는 마우스를 사용하는 것이 바람직하다.
성공적인 수술을 위해서는 마취의 선택이 중요합니다 (2.1 단계 참조). 다양한 유형의 마취는 수술의 난이도, 이식된 금속관의 상대적 위치, 유리창에 의한 뇌 압박 정도에 영향을 미치는 다양한 정도의 수술 중 뇌부종을 유발할 수 있습니다. 이러한 요인은 또한 수술 후 해마 뉴런의 생존에 영향을 미칠 수 있습니다.
해마를 노출시키는 흡인 과정(3.4단계 참조)에서 뇌 손상을 최소화하고 성공적인 이미징을 보장하기 위해 다음 사항에 유의해야 합니다. 두개골 창 측면에 배출구를 배치하여 조직 표면에 멸균 식염수를 지속적으로 공급하십시오. 흡인 중에 조직 표면이 공기에 노출되는 것을 방지하십시오. 조직 흡인의 기본 원리는 흡입 팁으로의 액체 흐름에 의해 조직 표면을 제거하는 것입니다. 흡입 팁이 조직에 직접 닿지 않도록 해야 합니다. 흡입 튜브에 가해지는 음압을 최소로 조정하십시오. 조직을 단계별로 흡인하고 각 단계에서 출혈이 조절되는지 확인합니다. 출혈이 길어지면 출혈이 자발적으로 멈출 때까지 기다리십시오. 멸균 식염수의 일정한 흐름으로 출혈 부위에서 가까운 거리에서 흡인을 유지하십시오. 조직을 흡인하여 유리 바닥 금속 튜브에 크기가 맞는 원통형 공간을 만듭니다(1.1단계 참조). 두꺼운 피알 혈관이나 큰 조직 조각을 흡인하려면 23G 바늘을, 작은 조직 파편을 흡입하려면 25G 바늘을 선택하십시오.
The authors have nothing to disclose.
XLPLN25XSVMP 대물렌즈를 빌려주신 M. Kondo와 M. Matsuzaki에게 감사드립니다. 이 연구는 일본 과학 진흥 협회 (JSPS)의 재정 지원을 받았으며 JSPS 연구원 (18J21331에서 R.K.로) 및 과학 연구 보조금 (20H00481, 20A301, 20H05894, 20H05895에서 SO), 일본 의학 연구 개발기구 (JP19gm1310003 및 JP17gm5010003에서 SO), 그리고 Moonshot R & D (JPMJMS2024에서 H.M.)의 일본 과학 기술기구.
23 G blunt needles | NIPRO | 02-166 | Suction tips for aspiration. |
25 G blunt needles | NIPRO | 02-167 | Suction tips for aspiration. |
3 mm dermal punches (DermaPunch) | Maruho | 213001610 | Tools for craniotomy. |
30 G needles | Dentronics | Disposable needle No. 30 | Tools for craniotomy. |
A femtosecond pulsed laser | Spectra-Physics | MaiTai Deep See | A Ti:Sapphire laser used at 920 nm wavelength. |
A two-photon microscope | Nikon | A1R MP+ | Microscope for the CA1 imaging. |
AAV1-CAG-FLEX-tdTomato | Penn Vector Core | AAV for neuronal labeling. | |
AAV1-hSyn-Cre | Penn Vector Core | AAV for neuronal labeling. | |
An objective lens for two-photon imaging | Olympus | XLPLN25XSVMP | 25× objective with a long working distance, a high numerical aperture, and a correction collar |
Aspirators | Shin-ei Industries | KS-500 | Tools for aspiration. |
Aluminum plates | Narishige | CP-1 | Plates made of alminum for head fixation. |
Chemical depilatory cream | YANAGIYA | Cream for hair removal around the surgical site. | |
Circular glass coverslips | Matsunami Glass | 3φ No.1 | Coverslips bonded to stainless steel tubes. |
CX3CR1-GFP mice | The Jackson Laboratory | 008451 | Transgenic mice for microglial imaging. |
Cylindrical stainless steel tubes | MORISHITA | Custom-made | Metal tubes to be implanted. Outer diameter 3.0 mm, inner diameter 2.8 mm, height 1.7 mm. |
Dental etching material | Sun Medical | 204610461 | Used to etch the skull bones. |
Dental resin cement (Super-Bond C&B) | Sun Medical | 204610555 | Dental cement. |
Dura pickers (Micro Points) | Fine Science Tools | 10063-15 | Tools for dura removal. |
Fine forceps (Dumont #5) | Fine Science Tools | 11252-20 | Surgical tools. |
Forceps | Bio Research Center | PRI13-3374 | Used to disinfect the surgical site. |
Head holding device | Narishige | MAG-2 | The head holding device of mice with angle adjusters |
Heating pad | Bio Research Center | BWT-100A and HB-10 | Tools to provide thermal support for the mouse during surgery. |
Heating pad | ALA Scientific | HEATINGPAD-1 and Hot-1 | Tools to provide thermal support for the mouse on the head holding device. |
Ketamine (Ketalar) | Daiichi Sankyo Company | S9-001665 | Anesthesia during surgery. |
Meloxicam | Tokyo Chemical Industry | M1959 | Analgesia during surgery. |
Ophthalmic ointment | Sato Pharmaceutical | Used to prevent eye dryness during surgery. | |
Povidone-iodine scrub solution | Meiji Seika Pharma | 2612701Q1137 | Used to disinfect the surgical site. |
Round-tipped miniature knives | Surgistar | 4769 | Surgical tools. |
Scalpel | MURANAKA MEDICAL INSTRUMENTS | 450-098-67 | Disposable surgical tool. |
Stereo microscopes | Leica Microsystems | S8 APO | Microscopes for surgery. |
Sterile saline | Otsuka Pharmaceutical Factory | 3311401A2026 | Washing solution during surgery. |
Sterile waterproof pad | AS ONE | 8-5945-01 | Surgical platform. |
Sulforhodamine 101 | Sigma-Aldrich | S7635 | A dye for in vivo vessel imaging. |
Surgical drape | Medline Industries | MP-0606F6T | Perforated drape for surgery. |
UV light | Toshiba | GL15 | Used to cure the adhesives. |
UV-curing optical adhesives | Thorlabs | NOA81 | Adhesives for bonding coverslips to stainless steel tubes. |
Xylazine (Celactal 2%) | Bayer | Anesthesia during surgery. |