Визуализация динамики связи актина и микротрубочек in vitro с помощью флуоресцентной микроскопии полного внутреннего отражения (TIRF)
Özet
Этот протокол является руководством для визуализации динамических актинов и микротрубочек с использованием микроскопического анализа in vitro полной внутренней флуоресценции (TIRF).
Abstract
Традиционно цитоскелеты актина и микротрубочек изучались как отдельные объекты, ограниченные конкретными клеточными областями или процессами и регулируемые различными наборами связывающих белков, уникальных для каждого полимера. Многие исследования в настоящее время демонстрируют, что динамика обоих цитоскелетных полимеров переплетена и что эти перекрестные помехи необходимы для большинства клеточных моделей поведения. Ряд белков, участвующих во взаимодействиях актин-микротрубочки, уже идентифицирован (т.е. Тау, МАКФ, ГАЗ, формины и т.д.) и хорошо охарактеризованы в отношении только актина или микротрубочек. Однако относительно немногие исследования показали анализы координации актин-микротрубочек с динамическими версиями обоих полимеров. Это может перекрыть возникающие механизмы связи между актином и микротрубочками. Здесь метод полной флуоресценции внутреннего отражения (TIRF) на основе микроскопии in vitro позволяет визуализировать динамику как актина, так и микротрубочек из одной биохимической реакции. Этот метод сохраняет динамику полимеризации либо актиновой нити, либо микротрубочек по отдельности или в присутствии другого полимера. Коммерчески доступный тау-белок используется для демонстрации того, как поведение актин-микротрубочек изменяется в присутствии классического цитоскелетного сшивающего белка. Этот метод может обеспечить надежное функциональное и механистическое понимание того, как отдельные регуляторные белки координируют динамику актин-микротрубочек при разрешении отдельных нитей или комплексов более высокого порядка.
Introduction
Исторически актин и микротрубочки рассматривались как отдельные сущности, каждая со своим собственным набором регуляторных белков, динамическим поведением и различными клеточными местоположениями. Многочисленные данные в настоящее время демонстрируют, что полимеры актина и микротрубочек участвуют в функциональных механизмах перекрестных помех, которые необходимы для выполнения многочисленных клеточных процессов, включая миграцию, позиционирование митотического веретена, внутриклеточный транспорт и морфологию клеток 1,2,3,4. Разнообразное скоординированное поведение, лежащее в основе этих примеров, зависит от сложного баланса факторов связи, сигналов и физических свойств. Тем не менее, молекулярные детали, лежащие в основе этих механизмов, до сих пор в значительной степени неизвестны, потому что большинство исследований сосредоточены на одном цитоскелетном полимере за раз 1,2,5.
Актин и микротрубочки напрямую не взаимодействуют 6,7,8. Скоординированная динамика актина и микротрубочек, наблюдаемая в клетках, опосредована дополнительными факторами. Многие белки, которые, как считается, регулируют перекрестные помехи актин-микротрубочки, были идентифицированы, и их активность хорошо характеризуется в отношении только цитоскелетного полимера 1,2. Растущие данные свидетельствуют о том, что этот однополимерный подход скрыл двойные функции некоторых белков / комплексов, которые позволяют событиям связи актин-микротрубочки 7,8,9,10,11,12,13. Эксперименты, в которых присутствуют оба полимера, редки и часто определяют механизмы с одним динамическим полимером и статически стабилизированной версией других 6,8,9,10,11,14,15,16,17,18 . Таким образом, необходимы методы для исследования эмерджентных свойств белков, координирующих актин-микротрубочки, которые могут быть полностью поняты только в экспериментальных системах, использующих оба динамических полимера.
Комбинация подходов к прямой маркировке белка, генетически закодированных меток сродства и микроскопии полной флуоресценции внутреннего отражения (TIRF) была применена с большим успехом в системах биомиметического восстановления 19,20,21,22,23. Многие схемы «снизу вверх» не содержат всех факторов, регулирующих белки в клетках. Однако технология «биохимия на покровном стекле» усовершенствовала многие механизмы динамики актина и микротрубочек в высоких пространственных и временных масштабах, включая компоненты, необходимые для сборки или разборки полимеров, и движение моторного белка 5,12,23,24,25,26,27 . Здесь описан минимальнокомпонентный однонитевой подход к исследованию связи актин-микротрубочек in vitro. Этот протокол может быть использован с коммерчески доступными или высокочистыми очищенными белками, флуоресцентно мечеными белками, перфузионными камерами и распространен на более сложные схемы, содержащие клеточные экстракты или синтетические системы. Здесь коммерчески доступный тау-белок используется для демонстрации того, как динамика цитоскелета изменяется в присутствии белка связи актин-микротрубочки, но может быть заменен другими предполагаемыми кодирующими факторы актин-микротрубочки. Основным преимуществом этой системы перед другими подходами является возможность одновременного мониторинга динамики нескольких цитоскелетных полимеров в одной реакции. Этот протокол также предоставляет пользователям примеры и простые инструменты для количественной оценки изменений цитоскелетных полимеров. Таким образом, пользователи протокола будут получать надежные, количественные данные о разрешении одной нити для описания механизмов, лежащих в основе того, как разнообразные регуляторные белки координируют динамику актин-микротрубочек.
Protocol
Representative Results
Discussion
Использование флуоресцентной микроскопии полного внутреннего отражения (TIRF) для визуализации очищенных белков было плодотворным и убедительным подходом к препарированию уникальных механизмов цитоскелетной регуляции 5,23,24,25,26,27,35. По сравнению с традиционными биохимическими анализами, реакции TIRF требуют очень малых объемов (50-100 мкл), а количественные измерения динамики цитоскелета могут быть получены из отдельного анализа. Большинство исследований динамики цитоскелета сосредоточены на одной полимерной системе (т.е. актиновых нитях или микротрубочках), поэтому подробные измерения перекрестных помех или эмерджентного поведения между актиновыми нитями и микротрубочками, обычно наблюдаемые в клетках, остаются неуловимыми и их трудно повторить в пробирке. Чтобы решить эту проблему, этот протокол описывает систему микроскопии TIRF с одной нитью, которая позволяет непосредственно визуализировать динамические полимеры актина и микротрубочек в одной и той же биохимической реакции. Таким образом, этот метод выходит за рамки традиционных анализов, которые повторяют динамическое поведение только актиновых нитей или микротрубочек. Этот метод также был выполнен с тау в качестве примера того, как несколько динамических свойств изменяются в присутствии фактора связи цитоскелетов. Этот протокол может быть использован с дополнительными белками, известными или подозреваемыми для координации динамики актина или микротрубочек, включая (но не ограничиваясь) MACF, GAS, формины и многое другое. Наконец, предоставленные примеры анализа могут быть использованы в качестве руководства для количественной оценки данных, полученных с помощью этого протокола.
«Видеть — значит верить» — это веская причина для проведения анализов на основе микроскопии. Однако при проведении и интерпретации экспериментов по микроскопии TIRF требуется осторожность. Одна из основных проблем цитоскелетных анализов совместной сборки заключается в том, что многие часто используемые условия визуализации не совместимы с каждым полимером. Микротрубочки и актин обычно имеют различные требования к буферу, температуре, соли, нуклеотидам и концентрации для полимеризации. Актин, тубулин, регуляторные белки, представляющие интерес, и буферы, используемые в этом протоколе, чувствительны к циклам замораживания-оттаивания. Поэтому для успешного выполнения этого протокола необходимо тщательное обращение с белками и буферами. Чтобы облегчить многие из этих проблем, настоятельно рекомендуется использовать свежепереработанный тубулин (замороженный в течение <6 недель) и предварительную очистку замороженных / повторно суспендированных актинов с помощью ультрацентрифугирования. Эти соображения также применимы к множеству регуляторных белков, подлежащих оценке с помощью этой процедуры, которые могут быть чувствительны к циклам замораживания-оттаивания или концентрации буферных солей 5,11,36.
К сожалению, не существует универсального буфера без экспериментальных компромиссов. Для присвоения большего объема белкам более низкой концентрации АТФ и ГТФ могут быть включены в 2-кратный буферный раствор TIRF (рис. 1С). Однако, поскольку эти нуклеотиды чрезвычайно чувствительны к циклам замораживания-оттаивания, это не рекомендуется. Используемые здесь кислородопоглощающие соединения (т.е. каталаза и глюкозооксидаза) необходимы для визуализации белков в течение длительных периодов времени (от минут до часов), но, как известно, ограничивают полимеризацию микротрубочек при высоких концентрациях5. В связи с этими буферными соображениями ограничение этого протокола заключается в том, что некоторым каноническим регуляторным белкам, связанным с микротрубочками, может потребоваться больше или меньше соли для рекапитуляции функций, обнаруженных в клетках или анализах с использованием одних только микротрубочек (без актина). Изменение природы или концентрации соли для решения этих проблем, вероятно, повлияет на скорость полимеризации актиновой нити и/или параметры динамики микротрубочек. Измерения нескольких описательных параметров (минимально, нуклеации, скорости удлинения и стабильности) (рисунок 3) необходимы для подтверждения успеха протокола или для явного документирования эффектов конкретных буферов или регуляторных белков. Например, слишком большая полимеризация актиновой нити может скрыть события связи актин-микротрубочки в течение нескольких секунд. Следовательно, тонкая настройка экспериментальных условий путем снижения общей концентрации актина или включения дополнительных белков для подавления нуклеации актина (т.е. профилина) продлит общий период, в течение которого можно будет четко увидеть скоординированную активность актин-микротрубочек. Элементы управления, отвечающие этим предварительным требованиям, и технические реплики (за пределами нескольких полей зрения) имеют решающее значение для пользователей для получения надежных и воспроизводимых результатов.
Клеточные исследования дают ограниченную возможность наблюдать прямые белково-белковые отношения или действие регуляторных комплексов. Напротив, некоторые из механизмов, почерпнутых из анализов in vitro, не всегда отражают точное поведение белков, наблюдаемое в клетках. Эта классическая дилемма биохимика может быть решена в будущих применениях этого метода с конкретными модификациями. Например, добавление функциональных флуоресцентно меченых соединительных белков расширяет этот метод от исследований с одной нитью до исследований с одной молекулой. Анализы могут быть дополнительно модифицированы для использования клеточных экстрактов, которые могут добавить «отсутствующие» неизвестные ключевые факторы, необходимые для повторения клеточных явлений. Например, анализы на основе TIRF с использованием дрожжей или экстрактов xenopus имеют восстановленные сократительные актомиозиновые кольца37, митотические веретена26,38, компоненты актина или сборки микротрубочек39,40 и даже динамику у центросом и кинетохоров 36,41,42,43 . Более того, такие системы могут проложить путь к системам искусственных клеток, которые имеют липиды или сигнальные факторы, присутствующие 44,45,46.
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Я благодарен Марку Ридилье (Repair Biotechnologies) и Брайану Хаареру (SUNY Upstate) за полезные комментарии по этому протоколу. Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения (GM133485).
Materials
| 1% BSA (w/v) | Fisher Scientific | BP1600-100 | For this purpose (blocking TIRF chambers), BSA is resuspended in ddH20 and filtered through a 0.22 µm filter. |
| 1× BRB80 | Homemade | 80 mM PIPES, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, pH 6.8 with KOH | |
| 10 mg/mL (1000 U) glucose oxidase | Sigma Aldrich Inc, St. Louis, MO | G2133-50KU | Combined with catalase, aliquot and store at -80 oC until use |
| 100 µM tubulin | Cytoskeleton Inc, Denver, CO | T240 | Homemade tubulins should be recycled before use to remove polymerization-incompetent tubulin (Hyman et al. (1992)29; Li and Moore (2020)30). Commercially available tubulins are often too dilute to recycle, but function well if resuspended according to manufacturer’s instructions and pre-cleared via ultracentrifugation (278,000 × g) for 60 min, before use. |
| 100 mM ATP | Gold Biotechnology Inc, Olivette, MO | A-081 | Resuspended in ddH20 (pH 7.5) and filter sterilized. |
| 100 mM GTP | Fisher Scientific | AC226250010 | Resuspended in 1× BRB80 (pH 6.8) and filter sterilized. |
| 120-150 mW solid-state lasers | Leica Microsystems | 11889151; 11889148 | |
| 2 mg/mL catalase | Sigma Aldrich Inc, St. Louis, MO | C40-100 | Combined with glucose oxidase, aliquot and store at -80 oC until use |
| 2× TIRF buffer | Homemade | 2× BRB80, 100 mM KCl, 20 mM DTT, 80 mM glucose, 0.5% (v/v) methylcellulose (4,000 cp); Note: 1 µL of 0.1M GTP and 1 µL of 0.1M ATP added separately to TIRF reactions to avoid repeated freeze-thaw cycles. | |
| 24 × 60 mm, #1.5 coverglass | Fisher Scientific, Waltham, MA | 22-266882 | Coverglass must be extensively washed before use (Smith et al. (2014)22) |
| 37 oC heatblock | |||
| 37 oC water bath | |||
| 5 mg/mL Streptavidin (600x stock) | Avantor, Philadelphia, PA | RLS000-01 | Resuspended in Tris-HCl (pH 8.8); dilute the aliquot to 1× in HEK buffer on day of use |
| 5 min Epoxy resin and hardener | Loctite, Rocky Hill, CT | 1365736 | Combined resin and hardener may take up to 30 min to cure. |
| 50% biotinylated-GpCpp microtubule seeds | Cytoskeleton Inc; Homemade | T333P | (optional) GppCpp or Taxol stabilized microtubule seeds can more efficiently mediate microtubule polymerization. Taxol and GppCpp stabilize microtubules in different ways that can affect the microtubule lattice structure and ability of certain regulatory proteins to bind to the stabilized portion of the microtubule. A method to make diverse kinds of microtubule seeds is outlined in Hyman et al. (1992). |
| 70 oC incubator | |||
| Actin mix stock | Homemade; this protocol | A 12.5 µM actin mix comprised of labeled (fluorescent and biotinylated) and unlabeled actin for up to six reactions. 2 µL of stock is used in the final TIRF reaction. The final concentration of actin used in each reaction is 0.5 µM (10% Alexa-647; 0.09% biotin-labeled). | |
| Appropriate buffer controls | Homemade | Combination of buffers from all proteins being assessed | |
| Biotin-PEG-silane (MW 3,400) | Laysan Bio Inc | biotin-PEG-SIL-3400 | Dispensed into 2-5 mg aliquots, backfilled with nitrogen, parafilmed closed, and stored at -20 oC with desiccant until use |
| Biotinylated actin | Cytoskeleton Inc; Homemade | AB07 | Biotin-actin is made by labeling on lysine residues and thus assumed to be at least 100% labeled, but varies with different lots/preparations. Optimal biotinylated actin concentrations must be empirically determined for particular uses/experimental designs. Higher concentrations permit more efficient tracking, but may impede polymerization or interactions with regulatory proteins. Here a small percentage (0.09% or 900 pM) biotinylated actin is present in the final TIRF reaction. |
| Dishsoap | Dawn, Procter and Gamble, Cincinnati, OH | For unknown reasons, the blue version cleans coverslips more efficiently than other available colors. | |
| Dry ice | |||
| FIJI Software | www.https://imagej.net/software/fiji/downloads | Schneider et al. (2012)31. | |
| Fluorescently labeled actin | Cytoskeleton Inc; Homemade | AR05 | Homemade fluorescently labeled actin is stored in G-buffer supplemented with 50% glycerol at -20 oC (Spudich et al. (1971)47; Liu et al. (2022)48). Fluorescently labeled actin is dialyzed against G-buffer and precleared via ultracentrifugation for 60 min at 278,000 × g before use. |
| Fluorescently labeled tubulin | Cytoskeleton Inc | TL488M, TLA590M, TL670M | Resuspended in 20 µL 1× BRB80 (10 µM final concentration) and pre-cleared via ultracentrifugation (278,000 × g) for 60 min, before use. |
| G-buffer | Homemade | 3 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.2 mM CaCl2, 0.5 mM DTT, 0.2 mM ATP | |
| HEK Buffer | Homemade | 20 mM HEPES (pH 7.5), 1 mM EDTA (pH 8.0), 50 mM KCl | |
| Ice | |||
| Ice bucket | |||
| Imaging chambers | IBIDI, Fitchburg, WI | 80666 | Order chambers with no bottom to utilize different coverslip coatings |
| iXon Life 897 EMCCD camera | Andor, Belfast, Northern Ireland | 8114137 | |
| LASX Premium microscope software | Leica Microsystems | 11640611 | |
| Methylcellulose (4,000 cp) | Sigma Aldrich Inc | M0512 | |
| Microscope base equipped with TIRF module | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | 11889146 | |
| mPEG-silane (MW 2,000) | Laysan Bio Inc, Arab, AL | mPEG-SIL-2000 | Dispensed into 10-15 mg aliquots, backfilled with nitrogen, parafilmed closed, and stored at -20 oC with desiccant until use |
| Objective heater and heated stage insert | OKO labs, Pozzioli, Italy | 8113569 | Set temperature controls to 35-37 oC. Use manufacturer suggestions for accurate calibration. |
| Perfusion pump | Harvard Apparatus, Holliston, MA | 704504 | A syringe and tubing can be substituted. |
| Petri Dish, 100 x 15 mm | Genesee Scientific, San Diego, CA | 32-107 | |
| Plastic slide mailer container | Fisher Scientific | HS15986 | |
| SA-S-1L-SecureSeal 0.12 mm thick | Grace Biolabs, Bend, OR | 620001 | Double-sided tape of precise manufactured dimensions is strongly recommended. |
| Small styrofoam container | Abcam, Cambridge, UK | Reused from shipping | |
| Small weigh boat | Fisher Scientific | 02-202-100 | |
| Spectrophotometer | |||
| Tau | Cytoskeleton Inc | TA01 | Three isoforms of Tau are present in the commercially available preparation of Tau. The concentration in this protocol was determined from the highest molecular weight band (14.3 µM, when resuspended per manufacturer’s recommendations with 50 µL of ddH20). |
| Temperature corrected 63× Plan Apo 1.47 N.A. oil immersion TIRF objective | Leica Microsystems | 11506319 | |
| Tubulin stock | Homemade; this protocol | A tubulin stock consisting of 7.2 µL recycled 100 µM unlabeled tubulin and 3 µL of 10 µM resuspended commercially available fluorescently labeled tubulin. One tubulin stock is used per reaction and thawed/stored on ice. The final concentration of free tubulin in each reaction is 15 µM (4% labeled). More than 15 µM tubulin will result in hyperstabilized (not dynamic) microtubules, whereas concentrations below 7.5 µM free tubulin do not polymerize well. Careful determination of protein concentration and handling is required. | |
| Unlabeled actin (dark) | Cytoskeleton Inc; Homemade | AKL99 | Actin nucleates are almost always present in commercially available (lyophilized) or frozen actins and contribute to variability in quantitative measurements (Spudich et al. (1971)47; Liu et al. (2022)48). Rabbit muscle actin is stored in G-buffer at -80 oC and precleared via ultracentrifugation for 60 min at 278,000 × g before use. Several actin stock solutions are made throughout the day (making no more than enough for six reactions at a time is strongly recommended). |
Referanslar
- Pimm, M. L., Henty-Ridilla, J. L. New twists in actin-microtubule interactions. Molecular Biology of the Cell. 32 (3), 211-217 (2021).
- Dogterom, M., Koenderink, G. H. Actin-microtubule crosstalk in cell biology. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 20 (1), 38-54 (2019).
- Etienne-Manneville, S. Actin and microtubules in cell motility: which one is in control. Traffic. 5 (7), 470-477 (2004).
- Rodriguez, O. C., et al. Conserved microtubule-actin interactions in cell movement and morphogenesis. Nature Cell Biology. 5 (7), 599-609 (2003).
- Prezel, E., et al. TIRF assays for real-time observation of microtubules and actin coassembly: Deciphering tau effects on microtubule/actin interplay. Methods in Cell Biology. 141, 199-214 (2017).
- Griffith, L. M., Pollard, T. D. The interaction of actin filaments with microtubules and microtubule-associated proteins. The Journal of Biological Chemistry. 257 (15), 9143-9151 (1982).
- Henty-Ridilla, J. L., Rankova, A., Eskin, J. A., Kenny, K., Goode, B. L. Accelerated actin filament polymerization from microtubule plus ends. Science. 352 (6288), 1004 (2016).
- Elie, A., et al. Tau co-organizes dynamic microtubule and actin networks. Scientific Reports. 5 (1), 1-10 (2015).
- Preciado López, M., et al. Actin-microtubule coordination at growing microtubule ends. Nature Communications. 5 (1), 1-9 (2014).
- Oberhofer, A., et al. Molecular underpinnings of cytoskeletal cross-talk. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (8), 3944-3952 (2020).
- Nakos, K., et al. Septins mediate a microtubule-actin crosstalk that enables actin growth on microtubules. bioRxiv. , (2022).
- Kučera, O., Gaillard, J., Guérin, C., Théry, M., Blanchoin, L. Actin-microtubule dynamic composite forms responsive active matter with memory. bioRxiv. , (2022).
- Kundu, T., Dutta, P., Nagar, D., Maiti, S., Ghose, A. Coupling of dynamic microtubules to F-actin by Fmn2 regulates chemotaxis of neuronal growth cones. Journal of Cell Science. 134 (13), 252916 (2021).
- Roth-Johnson, E. A., Vizcarra, C. L., Bois, J. S., Quinlan, M. E. Interaction between microtubules and the Drosophila formin Cappuccino and its effect on actin assembly. The Journal of Biological Chemistry. 289 (7), 4395-4404 (2014).
- Gaillard, J., et al. Differential interactions of the formins INF2, mDia1, and mDia2 with microtubules. Molecular Biology of the Cell. 22 (23), 4575-4587 (2011).
- Bartolini, F., et al. The formin mDia2 stabilizes microtubules independently of its actin nucleation activity. The Journal of Cell Biology. 181 (3), 523-536 (2008).
- Sider, J. R., et al. Direct observation of microtubule-F-actin interaction in cell free lysates. Journal of Cell Science. 112 (12), 1947-1956 (1999).
- Alkemade, C., et al. Cross-linkers at growing microtubule ends generate forces that drive actin transport. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (11), 2112799119 (2022).
- Axelrod, D. Total internal reflection fluorescence microscopy in cell biology. Methods in Enzymology. 361, 1-33 (2003).
- Amann, K. J., Pollard, T. D. Direct real-time observation of actin filament branching mediated by Arp2/3 complex using total internal reflection fluorescence microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (26), 15009-15013 (2001).
- Al-Bassam, J. Reconstituting dynamic microtubule polymerization regulation by TOG domain proteins. Methods in Enzymology. 540, 131-148 (2014).
- Smith, B. A., Gelles, J., Goode, B. L. Single-molecule studies of actin assembly and disassembly factors. Methods in Enzymology. 540, 95-117 (2014).
- Wioland, H., Jégou, A., Romet-Lemonne, G. Celebrating 20 years of live single-actin-filament studies with five golden rules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (3), 2109506119 (2022).
- Ganzinger, K. A., Schwille, P. More from less – bottom-up reconstitution of cell biology. Journal of Cell Science. 132 (4), (2019).
- Mahamdeh, M., Howard, J. Implementation of interference reflection microscopy for label-free, high-speed imaging of microtubules. Journal of Visualized Experiments. (150), e59520 (2019).
- King, M. R., Petry, S. Phase separation of TPX2 enhances and spatially coordinates microtubule nucleation. Nature Communications. 11 (1), 270 (2020).
- Ramirez-Rios, S., et al. A TIRF microscopy assay to decode how tau regulates EB’s tracking at microtubule ends. Methods in Cell Biology. 141, 179-197 (2017).
- Smith, B. A., et al. Three-color single molecule imaging shows WASP detachment from Arp2/3 complex triggers actin filament branch formation. eLife. 2, 01008 (2013).
- Hyman, A. A., Salser, S., Drechsel, D. N., Unwin, N., Mitchison, T. J. Role of GTP hydrolysis in microtubule dynamics: information from a slowly hydrolyzable analogue GMPCPP. Molecular Biology of the Cell. 3 (10), 1155-1167 (1992).
- Li, G., Moore, J. K. Microtubule dynamics at low temperature: evidence that tubulin recycling limits assembly. Molecular Biology of the Cell. 31 (11), 1154-1166 (2020).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Pollard, T. D., Blanchoin, L., Mullins, R. D. Molecular mechanisms controlling actin filament dynamics in nonmuscle cells. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 29, 545-576 (2000).
- Kapoor, V., Hirst, W. G., Hentschel, C., Preibisch, S., Reber, S. MTrack: Automated detection, tracking, and analysis of dynamic microtubules. Scientific Reports. 9 (1), 3794 (2019).
- Willige, D., et al. Cytolinker Gas2L1 regulates axon morphology through microtubule-modulated actin stabilization. EMBO reports. 20 (11), (2019).
- Hirst, W. G., Kiefer, C., Abdosamadi, M. K., Schäffer, E., Reber, S. In vitro reconstitution and imaging of microtubule dynamics by fluorescence and label-free microscopy. STAR Protocols. 1 (3), 100177 (2020).
- Farina, F., et al. The centrosome is an actin-organizing centre. Nature Cell Biology. 18 (1), 65-75 (2016).
- Mishra, M., et al. In vitro contraction of cytokinetic ring depends on myosin II but not on actin dynamics. Nature Cell Biology. 15 (7), 853-859 (2013).
- Groen, A. C., Ngyuen, P. A., Field, C. M., Ishihara, K., Mitchison, T. J. Glycogen-supplemented mitotic cytosol for analyzing Xenopus egg microtubule organization. Methods in Enzymology. 540, 417-433 (2014).
- Pollard, L. W., Garabedian, M. V., Alioto, S. L., Shekhar, S., Goode, B. L. Genetically inspired in vitro reconstitution of Saccharomyces cerevisiae actin cables from seven purified proteins. Molecular Biology of the Cell. 31 (5), 335-347 (2020).
- Bergman, Z. J., Wong, J., Drubin, D. G., Barnes, G. Microtubule dynamics regulation reconstituted in budding yeast lysates. Journal of Cell Science. 132 (4), 219386 (2018).
- Inoue, D., et al. Actin filaments regulate microtubule growth at the centrosome. The EMBO Journal. 38 (11), (2019).
- Colin, A., Singaravelu, P., Théry, M., Blanchoin, L., Gueroui, Z. Actin-network architecture regulates microtubule dynamics. Current Biology. 28 (16), 2647-2656 (2018).
- Torvi, J. R., et al. Reconstitution of kinetochore and microtubule dynamics reveals a role for a kinesin-8 in establishing end-on attachments. bioRxiv. , (2022).
- Nguyen, P. A., et al. Spatial organization of cytokinesis signaling reconstituted in a cell-free system. Science. 346 (6206), 244-247 (2014).
- Abu Shah, E., Keren, K. Symmetry breaking in reconstituted actin cortices. eLife. 3, 01433 (2014).
- Vendel, K. J. A., Alkemade, C., Andrea, N., Koenderink, G. H., Dogterom, M. In vitro reconstitution of dynamic co-organization of microtubules and actin filaments in emulsion droplets. Cytoskeleton Dynamics. 2101, 53-75 (2020).
- Spudich, J. A., Watt, S. The regulation of rabbit skeletal muscle contraction. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin. The Journal of Biological Chemistry. 246 (15), 4866-4871 (1971).
- Liu, X., Pimm, M. L., Haarer, B., Brawner, A. T., Henty-Ridilla, J. L. Biochemical characterization of actin assembly mechanisms with ALS-associated profilin variants. European Journal of Cell Biology. 101 (2), 151212 (2022).
- Pimm, M. L., Liu, X., Tuli, F., Lojko, A., Henty-Ridilla, J. L. Visualizing functional human profilin in cells and in vitro applications. bioRxiv. , (2021).
