이 프로토콜은 시험관내 총 내부 형광 (TIRF) 현미경 분석을 사용하여 동적 액틴 및 미세 소관을 시각화하기위한 가이드입니다.
전통적으로, 액틴 및 미세소관 세포골격은 별개의 독립체로서 연구되어 왔으며, 특정 세포 영역 또는 과정으로 제한되고, 각 중합체에 대해 고유한 결합 단백질의 상이한 스위트에 의해 조절된다. 많은 연구들은 이제 두 세포골격 중합체의 역학이 서로 얽혀 있으며, 이 누화는 대부분의 세포 행동에 필요하다는 것을 보여준다. 액틴-미세소관 상호작용에 관여하는 다수의 단백질(즉, 타우, MACF, GAS, 포르민 등)이 이미 확인되었으며, 액틴 또는 미세소관 단독과 관련하여 잘 특성화되어 있다. 그러나, 상대적으로 몇몇 연구는 두 중합체의 동적 버전과의 액틴-미세소관 조정의 검정을 보여주었다. 이것은 액틴과 미세 소관 사이의 창발적 연결 메커니즘을 막을 수 있습니다. 여기서, 전체 내부 반사 형광 (TIRF) 현미경-기반 시험관내 재구성 기술은 하나의 생화학적 반응으로부터 액틴 및 미세소관 역학 둘 다의 가시화를 허용한다. 이 기술은 액틴 필라멘트 또는 미세 소관의 중합 역학을 개별적으로 또는 다른 중합체의 존재하에 보존합니다. 상업적으로 입수가능한 타우 단백질은 고전적인 시토골격 가교 단백질의 존재하에서 액틴-미세소관 거동이 어떻게 변하는지를 입증하는데 사용된다. 이 방법은 개별 조절 단백질이 단일 필라멘트 또는 고차 복합체의 분해능에서 액틴-미세소관 역학을 어떻게 조정하는지에 대한 신뢰할 수 있는 기능적 및 기계론적 통찰력을 제공할 수 있다.
역사적으로, 액틴과 미세소관은 각각 그들 자신의 조절 단백질, 역학 행동 및 뚜렷한 세포 위치를 가진 별개의 실체로 간주되어 왔다. 풍부한 증거는 이제 액틴 및 미세 소관 중합체가 이동, 유사분열 스핀들 위치, 세포 내 수송 및 세포 형태학 1,2,3,4를 포함한 수많은 세포 과정을 실행하는 데 필수적인 기능적 누화 메커니즘에 관여한다는 것을 보여줍니다. 이러한 예의 기초가되는 다양한 조정 된 행동은 결합 요인, 신호 및 물리적 특성의 복잡한 균형에 달려 있습니다. 그러나 이러한 메커니즘을 뒷받침하는 분자 세부 사항은 대부분의 연구가 한 번에 단일 세포 골격 중합체에 초점을 맞추기 때문에 여전히 크게 알려지지 않았습니다 1,2,5.
액틴과 미세소관은 6,7,8과 직접 상호작용하지 않는다. 세포에서 볼 수있는 액틴과 미세 소관의 조정 된 역학은 추가 요인에 의해 매개됩니다. 액틴-미세소관 누화를 조절하는 것으로 생각되는 많은 단백질들이 확인되었으며, 이들의 활성은 세포골격 중합체 단독 1,2와 관련하여 잘 특성화되어 있다. 이러한 단일 폴리머 접근법이 액틴-미세소관 결합 사건 7,8,9,10,11,12,13을 가능하게 하는 일부 단백질/복합체의 이중 기능을 은폐했다는 증거가 늘어나고 있다. 두 중합체가 모두 존재하는 실험은 드물며 종종 단일 동적 중합체 및 다른 6,8,9,10,11,14,15,16,17,18의 정적 안정화 된 버전으로 메커니즘을 정의합니다. . 따라서, 두 동적 중합체를 모두 사용하는 실험 시스템에서만 완전히 이해될 수 있는 액틴-미세소관 조정 단백질의 창발적 특성을 조사하기 위한 방법이 필요하다.
직접 단백질 표지 접근법, 유전적으로 인코딩된 친화성 태그 및 총 내부 반사 형광(TIRF) 현미경의 조합은 생체모방 재구성 시스템 19,20,21,22,23에서 큰 성공을 거두어 적용되었다. 많은 상향식 체계는 세포의 단백질을 조절하는 모든 인자를 포함하지 않습니다. 그러나 “커버 글래스 상의 생화학”기술은 폴리머 조립 또는 분해에 필요한 구성 요소와 모터 단백질 이동 5,12,23,24,25,26,27을 포함하여 높은 공간 및 시간적 규모에서 액틴 및 미세 소관 역학의 많은 메커니즘을 개선했습니다. . 여기에 최소 성분 단일-액틴-미세소관 커플링을 시험관내에서 조사하기 위한 단일 필라멘트 접근법이 기재되어 있다. 이 프로토콜은 상업적으로 입수가능하거나 고도로 순수한 정제된 단백질, 형광 표지된 단백질, 관류 챔버와 함께 사용될 수 있고, 세포 추출물 또는 합성 시스템을 함유하는 보다 복잡한 반응식으로 확장될 수 있다. 여기서, 상업적으로 입수가능한 타우 단백질은 액틴-미세소관 결합 단백질의 존재 하에서 세포골격 역학이 어떻게 변하는지를 입증하기 위해 사용되지만, 다른 추정적 액틴-미세소관 배위 인자를 대체할 수 있다. 다른 접근법에 비해이 시스템의 주요 장점은 한 반응에서 여러 세포 골격 중합체의 역학을 동시에 모니터링 할 수 있다는 것입니다. 이 프로토콜은 또한 사용자에게 세포 골격 중합체의 변화를 정량화하는 예제와 간단한 도구를 제공합니다. 따라서, 프로토콜 사용자는 신뢰할 수 있고, 정량적이며, 단일 필라멘트 분해능 데이터를 생성하여, 다양한 조절 단백질이 액틴-미세소관 역학을 어떻게 조정하는지에 기초를 둔 메카니즘을 기술할 것이다.
시각화 된 정제 된 단백질에 대한 총 내부 반사 형광 (TIRF) 현미경의 사용은 세포 골격 조절 5,23,24,25,26,27,35의 독특한 메커니즘을 해부하기위한 유익하고 매력적인 접근법이었습니다. 전통적인 생화학 적 분석과 비교할 때, TIRF 반응은 매우 작은 부피 (50-100 μL)를 필요로하며, 세포 골격 역학의 정량적 측정은 개별 분석에서 수집 될 수 있습니다. 세포골격 역학에 대한 대부분의 연구는 단일 중합체 시스템 (즉, 액틴 필라멘트 또는 미세 소관)에 초점을 맞추고, 따라서 세포에서 전형적으로 보이는 액틴 필라멘트와 미세 소관 사이의 누화 또는 창발적 행동의 상세한 측정은 시험관에서 재검토하기가 어렵고 애매한 채로 남아있다. 이 문제를 해결하기 위해, 이 프로토콜은 동일한 생화학 반응에서 동적 액틴 및 미세소관 중합체의 직접적인 시각화를 가능하게 하는 단일 필라멘트 TIRF 현미경 시스템을 기술한다. 따라서이 방법은 액틴 필라멘트 또는 미세 소관의 동적 거동을 재검토하는 전통적인 분석을 뛰어 넘습니다. 이 기술은 또한 세포 골격 결합 인자의 존재하에 몇 가지 동적 특성이 어떻게 변하는지에 대한 예로서 타우와 함께 수행되었다. 이러한 프로토콜은 액틴 또는 미세소관 역학을 조정하기 위해 알려져 있거나 의심되는 추가의 단백질과 함께 사용될 수 있으며, MACF, GAS, 포르민 등을 포함하되 이에 한정되지 않는다. 마지막으로, 제공된 예제 분석을 이 프로토콜로 획득한 데이터를 정량화하기 위한 지침으로 사용할 수 있습니다.
“보는 것은 믿는 것”은 현미경 기반 분석을 수행하는 강력한 이유입니다. 그러나 TIRF 현미경 실험의 실행 및 해석에는 주의가 필요합니다. 세포골격 공동조립 분석의 한 가지 주요 과제는 일반적으로 사용되는 많은 이미징 조건이 각 중합체와 양립할 수 없다는 것이다. 미세소관 및 액틴은 전형적으로 중합을 위한 상이한 완충액, 온도, 염, 뉴클레오티드 및 농도 요건을 갖는다. 액틴, 튜불린, 관심있는 조절 단백질 및 이 프로토콜에 사용되는 완충제는 동결-해동 사이클에 민감하다. 따라서이 프로토콜을 성공적으로 실행하려면 단백질과 버퍼를주의 깊게 처리해야합니다. 이러한 많은 우려를 완화하기 위해 갓 재활용 된 튜불린 (<6 주 동안 냉동)을 사용하고 초 원심분리를 통해 냉동 / 재현탁 액틴을 미리 제거하는 것이 좋습니다. 이러한 고려사항은 또한 동결-해동 주기 또는 완충액 염 5,11,36의 농도에 민감할 수 있는 이 절차와 함께 평가될 수 있는 무수한 조절 단백질에도 적용된다.
불행히도, 실험적 트레이드 오프가없는 모든 크기의 버퍼는 존재하지 않습니다. 더 낮은 농도의 단백질에 대해 더 많은 부피를 적절하게하기 위해, ATP 및 GTP는 2x TIRF 완충 용액에 포함될 수 있다(도 1C). 그러나, 이들 뉴클레오티드는 동결-해동 주기에 매우 민감하기 때문에, 권장되지 않는다. 여기에 사용된 산소 소거용 화합물(즉, 카탈라아제 및 글루코스-옥시다제)은 장기간(분에서 시간)동안 단백질을 시각화하는 데 필요하지만, 고농도에서 미세소관 중합을 제한하는 것으로 알려져 있다5. 이러한 완충액 고려사항과 관련하여, 이 프로토콜의 한계는 일부 정준 미세소관-관련 조절 단백질이 미세소관 단독(액틴 없이)을 사용하는 세포 또는 분석에서 발견되는 기능을 재검토하기 위해 더 많거나 적은 염을 필요로 할 수 있다는 것이다. 이러한 우려를 해결하기 위해 염의 성질 또는 농도를 변경하는 것은 액틴 필라멘트 중합 속도 및 / 또는 미세 소관 역학의 매개 변수에 영향을 줄 수 있습니다. 여러 설명 파라미터(최소, 핵형성, 신장률 및 안정성)의 측정(그림 3)은 프로토콜 성공을 확인하거나 특정 완충제 또는 조절 단백질의 효과를 명시적으로 문서화하는 데 필요합니다. 예를 들어, 너무 많은 액틴 필라멘트 중합은 수초 내에 액틴-미세소관 결합 이벤트를 흐리게 할 수 있다. 결과적으로, 액틴의 전체 농도를 낮추거나 액틴 핵생성을 억제하기 위한 추가적인 단백질(즉, 프로필린)을 포함함으로써 실험 조건을 미세 조정하면 액틴-미세소관 활동을 배위하는 전체 기간이 연장되어 명확하게 볼 수 있다. 이러한 필수 구성 요소를 다루는 컨트롤과 기술 반복실험(여러 보기 영역 이상)은 사용자가 안정적이고 재현 가능한 결과를 생성하는 데 매우 중요합니다.
세포 기반 연구는 직접적인 단백질-단백질 관계 또는 조절 복합체의 작용을 관찰할 수 있는 제한된 기회를 제공한다. 대조적으로, 시험관내 분석으로부터 수집된 메카니즘 중 일부는 항상 세포에서 보이는 단백질의 정확한 거동을 반영하지는 않는다. 이 고전적인 생화학자의 딜레마는 특정 수정으로이 기술의 향후 적용에서 해결 될 수 있습니다. 예를 들어, 기능적 형광 표지 결합 단백질을 추가하면 이 방법이 단일 필라멘트 연구에서 단일 분자 연구로 확장됩니다. 분석은 세포 유사 현상을 재촉하는 데 필요한 “누락된” 알려지지 않은 핵심 인자를 추가할 수 있는 세포 추출물을 사용하도록 추가로 변형될 수 있다. 예를 들어, 효모 또는 제노푸스 추출물을 사용하는 TIRF 기반 검정은 수축성 암토묘신 고리 37, 유사분열 스핀들 26,38, 액틴 또는 미세소관 어셈블리의 성분39,40, 심지어 센트로솜 및 키네토코레 36,41,42,43에서의 역학을 재구성하였다. . 더욱이, 이러한 시스템은 지질 또는 신호전달 인자가 존재하는 인공 세포 시스템(44,45,46)을 향한 길을 닦을 수 있다.
The authors have nothing to disclose.
Marc Ridilla (Repair Biotechnologies)와 Brian Haarer (SUNY Upstate)에게이 프로토콜에 대한 유용한 의견에 감사드립니다. 이 연구는 국립 보건원 (GM133485)의 지원을 받았다.
1% BSA (w/v) | Fisher Scientific | BP1600-100 | For this purpose (blocking TIRF chambers), BSA is resuspended in ddH20 and filtered through a 0.22 µm filter. |
1× BRB80 | Homemade | 80 mM PIPES, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, pH 6.8 with KOH | |
10 mg/mL (1000 U) glucose oxidase | Sigma Aldrich Inc, St. Louis, MO | G2133-50KU | Combined with catalase, aliquot and store at -80 oC until use |
100 µM tubulin | Cytoskeleton Inc, Denver, CO | T240 | Homemade tubulins should be recycled before use to remove polymerization-incompetent tubulin (Hyman et al. (1992)29; Li and Moore (2020)30). Commercially available tubulins are often too dilute to recycle, but function well if resuspended according to manufacturer’s instructions and pre-cleared via ultracentrifugation (278,000 × g) for 60 min, before use. |
100 mM ATP | Gold Biotechnology Inc, Olivette, MO | A-081 | Resuspended in ddH20 (pH 7.5) and filter sterilized. |
100 mM GTP | Fisher Scientific | AC226250010 | Resuspended in 1× BRB80 (pH 6.8) and filter sterilized. |
120-150 mW solid-state lasers | Leica Microsystems | 11889151; 11889148 | |
2 mg/mL catalase | Sigma Aldrich Inc, St. Louis, MO | C40-100 | Combined with glucose oxidase, aliquot and store at -80 oC until use |
2× TIRF buffer | Homemade | 2× BRB80, 100 mM KCl, 20 mM DTT, 80 mM glucose, 0.5% (v/v) methylcellulose (4,000 cp); Note: 1 µL of 0.1M GTP and 1 µL of 0.1M ATP added separately to TIRF reactions to avoid repeated freeze-thaw cycles. | |
24 × 60 mm, #1.5 coverglass | Fisher Scientific, Waltham, MA | 22-266882 | Coverglass must be extensively washed before use (Smith et al. (2014)22) |
37 oC heatblock | |||
37 oC water bath | |||
5 mg/mL Streptavidin (600x stock) | Avantor, Philadelphia, PA | RLS000-01 | Resuspended in Tris-HCl (pH 8.8); dilute the aliquot to 1× in HEK buffer on day of use |
5 min Epoxy resin and hardener | Loctite, Rocky Hill, CT | 1365736 | Combined resin and hardener may take up to 30 min to cure. |
50% biotinylated-GpCpp microtubule seeds | Cytoskeleton Inc; Homemade | T333P | (optional) GppCpp or Taxol stabilized microtubule seeds can more efficiently mediate microtubule polymerization. Taxol and GppCpp stabilize microtubules in different ways that can affect the microtubule lattice structure and ability of certain regulatory proteins to bind to the stabilized portion of the microtubule. A method to make diverse kinds of microtubule seeds is outlined in Hyman et al. (1992). |
70 oC incubator | |||
Actin mix stock | Homemade; this protocol | A 12.5 µM actin mix comprised of labeled (fluorescent and biotinylated) and unlabeled actin for up to six reactions. 2 µL of stock is used in the final TIRF reaction. The final concentration of actin used in each reaction is 0.5 µM (10% Alexa-647; 0.09% biotin-labeled). | |
Appropriate buffer controls | Homemade | Combination of buffers from all proteins being assessed | |
Biotin-PEG-silane (MW 3,400) | Laysan Bio Inc | biotin-PEG-SIL-3400 | Dispensed into 2-5 mg aliquots, backfilled with nitrogen, parafilmed closed, and stored at -20 oC with desiccant until use |
Biotinylated actin | Cytoskeleton Inc; Homemade | AB07 | Biotin-actin is made by labeling on lysine residues and thus assumed to be at least 100% labeled, but varies with different lots/preparations. Optimal biotinylated actin concentrations must be empirically determined for particular uses/experimental designs. Higher concentrations permit more efficient tracking, but may impede polymerization or interactions with regulatory proteins. Here a small percentage (0.09% or 900 pM) biotinylated actin is present in the final TIRF reaction. |
Dishsoap | Dawn, Procter and Gamble, Cincinnati, OH | For unknown reasons, the blue version cleans coverslips more efficiently than other available colors. | |
Dry ice | |||
FIJI Software | www.https://imagej.net/software/fiji/downloads | Schneider et al. (2012)31. | |
Fluorescently labeled actin | Cytoskeleton Inc; Homemade | AR05 | Homemade fluorescently labeled actin is stored in G-buffer supplemented with 50% glycerol at -20 oC (Spudich et al. (1971)47; Liu et al. (2022)48). Fluorescently labeled actin is dialyzed against G-buffer and precleared via ultracentrifugation for 60 min at 278,000 × g before use. |
Fluorescently labeled tubulin | Cytoskeleton Inc | TL488M, TLA590M, TL670M | Resuspended in 20 µL 1× BRB80 (10 µM final concentration) and pre-cleared via ultracentrifugation (278,000 × g) for 60 min, before use. |
G-buffer | Homemade | 3 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.2 mM CaCl2, 0.5 mM DTT, 0.2 mM ATP | |
HEK Buffer | Homemade | 20 mM HEPES (pH 7.5), 1 mM EDTA (pH 8.0), 50 mM KCl | |
Ice | |||
Ice bucket | |||
Imaging chambers | IBIDI, Fitchburg, WI | 80666 | Order chambers with no bottom to utilize different coverslip coatings |
iXon Life 897 EMCCD camera | Andor, Belfast, Northern Ireland | 8114137 | |
LASX Premium microscope software | Leica Microsystems | 11640611 | |
Methylcellulose (4,000 cp) | Sigma Aldrich Inc | M0512 | |
Microscope base equipped with TIRF module | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | 11889146 | |
mPEG-silane (MW 2,000) | Laysan Bio Inc, Arab, AL | mPEG-SIL-2000 | Dispensed into 10-15 mg aliquots, backfilled with nitrogen, parafilmed closed, and stored at -20 oC with desiccant until use |
Objective heater and heated stage insert | OKO labs, Pozzioli, Italy | 8113569 | Set temperature controls to 35-37 oC. Use manufacturer suggestions for accurate calibration. |
Perfusion pump | Harvard Apparatus, Holliston, MA | 704504 | A syringe and tubing can be substituted. |
Petri Dish, 100 x 15 mm | Genesee Scientific, San Diego, CA | 32-107 | |
Plastic slide mailer container | Fisher Scientific | HS15986 | |
SA-S-1L-SecureSeal 0.12 mm thick | Grace Biolabs, Bend, OR | 620001 | Double-sided tape of precise manufactured dimensions is strongly recommended. |
Small styrofoam container | Abcam, Cambridge, UK | Reused from shipping | |
Small weigh boat | Fisher Scientific | 02-202-100 | |
Spectrophotometer | |||
Tau | Cytoskeleton Inc | TA01 | Three isoforms of Tau are present in the commercially available preparation of Tau. The concentration in this protocol was determined from the highest molecular weight band (14.3 µM, when resuspended per manufacturer’s recommendations with 50 µL of ddH20). |
Temperature corrected 63× Plan Apo 1.47 N.A. oil immersion TIRF objective | Leica Microsystems | 11506319 | |
Tubulin stock | Homemade; this protocol | A tubulin stock consisting of 7.2 µL recycled 100 µM unlabeled tubulin and 3 µL of 10 µM resuspended commercially available fluorescently labeled tubulin. One tubulin stock is used per reaction and thawed/stored on ice. The final concentration of free tubulin in each reaction is 15 µM (4% labeled). More than 15 µM tubulin will result in hyperstabilized (not dynamic) microtubules, whereas concentrations below 7.5 µM free tubulin do not polymerize well. Careful determination of protein concentration and handling is required. | |
Unlabeled actin (dark) | Cytoskeleton Inc; Homemade | AKL99 | Actin nucleates are almost always present in commercially available (lyophilized) or frozen actins and contribute to variability in quantitative measurements (Spudich et al. (1971)47; Liu et al. (2022)48). Rabbit muscle actin is stored in G-buffer at -80 oC and precleared via ultracentrifugation for 60 min at 278,000 × g before use. Several actin stock solutions are made throughout the day (making no more than enough for six reactions at a time is strongly recommended). |