全内部反射蛍光(TIRF)顕微鏡によるアクチンと微小管結合ダイナミクスのイン ビトロでの 可視化
Özet
このプロトコルは、 in vitro 全内部蛍光(TIRF)顕微鏡アッセイを使用して動的アクチンおよび微小管を視覚化するためのガイドです。
Abstract
伝統的に、アクチンおよび微小管細胞骨格は、別個の実体として研究され、特定の細胞領域またはプロセスに制限され、各ポリマーに固有の結合タンパク質の異なるスイートによって調節されてきた。多くの研究は、両方の細胞骨格ポリマーのダイナミクスが絡み合っており、このクロストークがほとんどの細胞行動に必要であることを実証しています。アクチン-微小管相互作用に関与する多くのタンパク質(すなわち、タウ、MACF、GAS、ホルミンなど)がすでに同定されており、アクチンまたは微小管のみに関して十分に特徴付けられている。しかし、比較的少数の研究は、両方のポリマーの動的バージョンとのアクチン – 微小管配位アッセイを示した。これは、アクチンと微小管との間の創発的な連結機構を閉塞する可能性がある。ここで、全反射蛍光(TIRF)顕微鏡ベースの in vitro 再構成技術は、1つの生化学反応からアクチンおよび微小管の両方のダイナミクスの視覚化を可能にする。この技術は、アクチンフィラメントまたは微小管のいずれかの重合動力学を個々に、または他のポリマーの存在下で保存する。市販のタウタンパク質は、古典的な細胞骨格架橋タンパク質の存在下でアクチン – 微小管挙動がどのように変化するかを実証するために使用される。この方法は、個々の調節タンパク質が単一フィラメントまたは高次複合体の分解能でアクチン – 微小管ダイナミクスをどのように調整するかについての信頼性の高い機能的および機構的洞察を提供することができる。
Introduction
歴史的に、アクチンと微小管は別々の実体と見なされ、それぞれが独自の調節タンパク質のセット、ダイナミクス行動、および異なる細胞位置を有する。アクチンおよび微小管ポリマーが、遊走、有糸分裂紡錘体位置決め、細胞内輸送、および細胞形態を含む多数の細胞プロセスを実行するために不可欠な機能的クロストーク機構に関与することを、現在実証している1,2,3,4。これらの例の根底にある多様な協調挙動は、結合因子、信号、および物理的特性の複雑なバランスに依存しています。しかし、これらのメカニズムを支える分子の詳細は、ほとんどの研究が一度に単一の細胞骨格ポリマーに焦点を当てているため、まだほとんど不明です1,2,5。
アクチンと微小管は直接相互作用しない6、7、8。細胞に見られるアクチンおよび微小管の協調ダイナミクスは、追加の因子によって媒介される。アクチン-微小管クロストークを調節すると考えられる多くのタンパク質が同定されており、その活性は細胞骨格ポリマー単独のいずれに関しても十分に特徴付けられている1,2。増え続ける証拠は、この単一のポリマーアプローチが、アクチン – 微小管結合事象7,8,9,10,11,12,13を可能にするいくつかのタンパク質/複合体の二重機能を隠蔽したことを示唆している。両方のポリマーが存在する実験はまれであり、しばしば単一の動的ポリマーおよび他の6,8,9,10,11,14,15,16,17,18の静的安定化バージョンによるメカニズムを定義する.したがって、アクチン-微小管調整タンパク質の創発的な特性を調査するには、両方の動的ポリマーを使用する実験系でのみ完全に理解できる方法が必要である。
直接タンパク質標識アプローチ、遺伝的にコードされた親和性タグ、および全内部反射蛍光(TIRF)顕微鏡法の組み合わせは、生体模倣再構成系において大きな成功を収めて適用されている19、20、21、22、23。多くのボトムアップスキームには、細胞内のタンパク質を調節するすべての因子が含まれているわけではありません。しかし、「カバーグラス上の生化学」技術は、ポリマーの組み立てまたは分解に必要な成分、およびモータータンパク質の動きを含む、高い空間的および時間的スケールでのアクチンおよび微小管ダイナミクスの多くのメカニズムを洗練させました5、12、23、24、25、26、27.ここでは、インビトロでアクチン-微小管結合を調査するための最小成分単一フィラメントアプローチが記載されている。このプロトコールは、市販または高純度の精製タンパク質、蛍光標識タンパク質、灌流チャンバー、および細胞抽出物または合成系を含むより複雑なスキームに拡張して使用することができる。ここで、市販のタウタンパク質は、アクチン-微小管結合タンパク質の存在下で細胞骨格ダイナミクスがどのように変化するかを実証するために使用されるが、他の推定アクチン-微小管協調因子と置き換えることができる。他のアプローチに対するこのシステムの主な利点は、1つの反応で複数の細胞骨格ポリマーのダイナミクスを同時に監視できることです。このプロトコルは、細胞骨格ポリマーへの変化を定量化するための例と簡単なツールをユーザーに提供します。したがって、プロトコルユーザーは、信頼性の高い定量的なシングルフィラメント分解能データを生成して、多様な調節タンパク質がアクチン-微小管ダイナミクスをどのように調整するかの根底にあるメカニズムを記述します。
Protocol
1. カバースリップの洗浄 注:洗濯(24 mm x 60 mm、#1.5)は、Smith et al., 201328に従ってカバースリップを覆います。 プラスチック製のスライドメーラー容器にカバースリップを配置します。 カバースリップを以下の溶液に順次沈め、30〜60分間超音波処理し、各溶液の間にddH2Oで10回すすいだ。0.1 M KOH.カバースリップを100%エタノールで最大6ヶ月間保管してください。注:ガラスの表面を愛されていない指で触れないでください。代わりに鉗子を使用してください。 2. コーティング洗浄済み(24 mm x 60 mm、#1.5)カバースリップをmPEGおよびビオチン-PEGシランで 注:このプロトコルは、特にビオチン – ストレプトアビジン系を使用して、アクチンおよび微小管をTIRFイメージング平面内に配置します。他のコーティングおよび系が使用され得る(例えば、抗体、ポリ−L−リジン、NEMミオシンなど)。 PEGシランおよびビオチン-PEG-シラン粉末のアリコートを解凍する。 PEG粉末を80%エタノール(pH 2.0)に溶解して、使用直前に10 mg/mL mPEGシランおよび2-4 mg/mLビオチン-PEGシランのコーティングストック溶液を生成します。注:PEG粉末はしばしば溶解しているように見えますが、微視的なレベルではないかもしれません。適切な再懸濁は、一定のピペッティングで約1〜2分かかります。使用者は、粉末溶解の出現に続いてさらに10回ピペットをすることが推奨される。注意: 80%エタノール(pH 2.0)を作るときは、濃縮HClから皮膚を保護するために手袋を着用してください。 鉗子を使用してエタノール貯蔵庫から清潔なカバースリップ(24 mm x 60 mm、#1.5)を取り外します。窒素ガスで乾燥させ、清潔なペトリ皿に保管してください。 80%エタノール(pH 2.0)に2 mg/mL mPEGシラン(MW 2,000)と0.04 mg/mLビオチン-PEGシラン(MW 3,400)を混合した100 μLのコーティング溶液でカバースリップをコーティングします。注:スパースコーティング(推奨)には、2 mg/mL mPEGシランおよび0.04 mg/mLビオチン-PEGシランを使用してください。緻密なコーティングには、2 mg/mL mPEGシラン、4 mg/mL ビオチン-PEGシランを使用してください。 カバースリップを70°Cで少なくとも18時間、または使用時までインキュベートする。注:コーティングされたカバースリップは、70°Cで2週間以上保存すると劣化します。 3. イメージングフローチャンバの組み立て 両面テープ12枚を24mmの長さにカットします。テープバッキングの片側を取り外し、クリーンなイメージングチャンバにある6つの溝に隣接するテープ片を固定します。メモ:正しく組み立てるにはテープを平らにする必要があります。そうしないと、イメージングチャンバが漏れます。テープの裏地を慎重に取り外して、バンプが発生しないようにします。テープチャンバの接触を滑らかにするために、テープチャンバを清潔な表面上にスライドさせることをお勧めします。 2枚目のテープバッキングを取り外して、各チャンバ溝に沿ってテープの粘着性側を露出させます。チャンバーテープの側面を上にして清潔な面に置きます。 エポキシ樹脂と硬化剤溶液を1:1(または製造元の指示に従って)小さな計量ボートで混合します。 P1000チップを使用して、各イメージングチャンバ溝の端にあるテープストリップ間に混合エポキシの滴を置きます(赤い矢印; 図1A)。チャンバーテープ/エポキシ面を上向きにして清潔な面に置きます。 コーティングされたカバースリップを70°Cのインキュベーターから取り出します。カバースリップのコーティングされた表面とコーティングされていない表面をddH2Oで6回すすぎ、ろ過された窒素ガスで乾燥させた後、カバースリップコーティング側をテープに向かってイメージングチャンバに貼り付けます。 P200 または P1000 ピペットチップを使用してテープとガラスのインターフェースに圧力をかけ、テープとカバースリップの間の良好なシールを確保します。メモ:適切なシールを貼付すると、両面テープは半透明になります。十分なテープチャンバ接点のないイメージングチャンバは漏れます。 組み立てられたチャンバを室温で少なくとも5〜10分間インキュベートして、エポキシが使用前にチャンバウェルを完全に密封できるようにします。灌流チャンバーは、組み立てから12〜18時間以内に期限切れになります。メモ:テープの配置と使用する両面テープの厚さに応じて、組み立てられたチャンバの最終容量は20〜50μLになります。 4. 灌流チャンバーのコンディショニング 灌流ポンプ(速度500 μL/分に設定)を使用して、灌流チャンバー内のコンディショニング溶液を次のように順次交換します。 50 μL の 1% BSA を流してイメージングチャンバーをプライミングします。ルアーロックフィッティングリザーバから余分なバッファを取り除きます。 50 μL の 0.005 mg/mL ストレプトアビジンを流します。室温で1〜2分間インキュベートする。リザーバから余分なバッファを取り除きます。 50 μLの1% BSAを流して、非特異的結合をブロックします。10〜30秒間インキュベートする。リザーバから余分なバッファを取り除きます。 50 μL の温かい (37 °C) 1x TIRF バッファー (1x BRB80、50 mM KCl、10 mM DTT、40 mM グルコース、0.25% (v/v) メチルセルロース (4,000 cp)) を流します。メモ: リザーバから余分なバッファを取り出さないでください。これにより、チャンバが乾燥するのを防ぎ、システムに気泡を導入する可能性があります。 オプション:1x TIRFバッファーで希釈した安定化29 %および50%ビオチン化微小管種子50μLを流します。注: 適切な希釈は経験的に決定され、バッチごとの変動性が含まれている必要があります。27,29 からのプロトコルが出発点として推奨されます。視野あたり10〜30個の種子を生じる希釈は、この設定でうまく機能します。 5. 顕微鏡の準備 注:動的アクチンフィラメントおよび微小管を含む生化学反応は、120-150mWの固体レーザー、温度補正された63倍の油浸TIRF対物レンズ、およびEMCCDカメラを備えた倒立全反射蛍光(TIRF)顕微鏡を使用して視覚化/実行されます。この例のタンパク質は、次の波長で可視化される:488nm(微小管)および647nm(アクチン)。 最初の生化学反応をイメージングする前に、ステージ/対物ヒータ装置を少なくとも30分間35〜37°Cに維持するように設定します。 画像集録パラメータを次のように設定します。 集録間隔を15~20分間5秒ごとに設定します。 488 および 647 レーザー露光を 5%~10% の電力で 50 ~ 100 ミリ秒に設定します。顕微鏡に適したTIRF角度を設定します。メモ: 顕微鏡の設定に関係なく、レーザー出力、露出、および TIRF 角度を設定する最も簡単な方法は、いずれかのポリマーのみの画像を調整することです (下記の 5.2.2.1 および 5.2.2.2 を参照)。ユーザーは、検出を許可する最も低いレーザー出力と露出設定を使用することを強くお勧めします。 重合反応を調整し(図1C)、アクチンフィラメントアセンブリを開始し、647nmで画像を取得します。適切な調整を行います。 第2の馴化灌流ウェルで重合反応を調整して微小管アセンブリを開始し(図1C)、488nmで可視化する。適切な調整を行います。 6. タンパク質反応ミックスの調製 蛍光標識されたチューブリンの原液を調製する。 Abs280での分光光度法によって自家製非標識チューブリンの濃度を次のように決定する: GTPを欠いている1xBRB80を備えたブランク分光光度計。 115,000 M-1 cm-1の決定された吸光係数と以下の式を使用してチューブリンの濃度を計算します。 市販の凍結乾燥リジン標識488-チューブリンを10 μM(1 mg/mL;100%標識)に、GTPを欠損した1x BRB80 20 μLで再懸濁する。 100 μM の未標識リサイクルチューブリン29 の 7.2 μL アリコートを氷上で解凍します。注:リサイクルされたチューブリンは、凍結タンパク質ストック29,30で形成された重合不能な二量体を除去するため、インビトロでの微小管アセンブリを成功させるために重要です。 3 μL の 10 μM 488-チューブリンと 7.2 μL の 100 μM 非標識チューブリンのアリコートを、使用前に 15 分以内に組み合わせます。 蛍光標識アクチンの原液を調製する。 自家製タンパク質の場合、分光光度法Abs290およびAbs650を介してアクチンの濃度およびパーセント標識を以下のように決定する: Gバッファー付きブランク分光光度計。 25,974 M-1 cm-1の決定された吸光係数と下記式を使用して、非標識アクチンの濃度を計算します。 非標識アクチンの吸光係数、0.03の蛍光補正係数、および下記式を使用して、標識Alexa-647-アクチンのリジン濃度を計算します。[Alexa-647アクチン]、μM=(Abs290 – Alexa-647 の 239,000 M-1 cm-1 のε を使用して、Alexa-647-アクチンのラベルパーセントを次のように計算します。Alexa-647-アクチンの%ラベル=(Abs290 – ( 3 μM 100%標識ビオチン-アクチン(リジン残基に標識)の2 μLアリコート1個を解凍する。18 μLのGバッファーを加えて10倍希釈する。 3 μL の希釈ビオチン化アクチン、適切な容量の非標識および標識アクチン (上記) を組み合わせて、最終ミックスが 10% ~ 30% の蛍光標識を持つ総アクチンが 12.5 μM になるようにします。注:30%を超える蛍光アクチンモノマー(最終)は、フィラメントがバックグラウンドから識別しにくくなるため、イメージング解像度を損なう可能性があります。 反応混合物を調製する(図1C)。 イメージングの15分前までに、12.5 μMアクチンミックスストック(6.2.3)の2 μLとチューブリンストックミックス(6.1.4)を組み合わせて、細胞骨格ミックス(チューブA)を調製します。使用時まで氷の上に保管してください。 2x TIRFバッファー、抗漂白剤、ヌクレオチド、バッファー、およびアクセサリータンパク質を含む他のすべての実験コンポーネントとタンパク質を組み合わせて、タンパク質反応ミックス(チューブB)を調製します。その一例を 図1Cに示す。注: 最終的な希釈により、推定生理学的範囲内の ATP、GTP、およびイオン強度を含む 1x TIRF バッファーが生成されます。 チューブAとチューブBを別々に37°Cで30〜60秒間インキュベートする。反応を開始するには、チューブBの内容物を混合し、チューブAに加える(下記)。 7. 画像アクチンと微小管のダイナミクス 条件はよく灌流する(図1B;ステップ4、上記)。 チューブB(反応ミックス)の内容物をチューブA(細胞骨格ミックス)に加えることによって、アクチンと微小管のアセンブリを同時に開始します(図1C)。 15 μM 遊離チューブリン、1 mM GTP、および 0.5 μM アクチンモノマー、および適切な量のバッファーコントロールを添加した 1x TIRF バッファーを含む反応のフロー 50 μL 。 顕微鏡ソフトウェアを使用してタイムラプスムービーを記録し、5秒ごとに15〜20分間取得します。注:アクチンおよび微小管ダイナミクスの開始は、2〜5分以内に起こる(図2)。より長い遅延は、温度制御の問題または反応混合物中のタンパク質の濃度関連の問題を示す。 新しい灌流ウェルをコンディショニングし(ステップ4)、バッファー容量を目的の調節タンパク質(すなわち、Tau)およびバッファーコントロールに置き換えます(図1C)。ステップ7(上記)で概説したように取得して、創発的なアクチン – 微小管機能に対する調節タンパク質を評価する。 8. フィジーソフトウェアを使用した画像の処理と分析31 保存した TIRF ムービーを開き、コンポジットとして表示します。 微小管のダイナミクスを次のように解析します(図3A)。 画像スタックメニューから時間ベースの最大Z投影法を生成します。 Z プロジェクションウィンドウを元の TIRF ムービーと同期 するには>「分析>ツール」の「ウィンドウを同期」メニューから選択 します。 直線ツールを使用して、時間投影画像上の目的の微小管に沿って線を描画します。 分析メニューから関心領域 (ROI) マネージャーを開きます (分析>ツール> ROI マネージャー)。 個々の微小管の位置を保存するには、「t」を押します。目的のすべての微小管について、この手順を繰り返します。 「/」を用いて選択された線のキモグラフをプロットするか、またはROIマネージャ31において微小管毎にビデオおよびキモグラフを生成するマルチキモマクロを実行する。 長さ(μm)と時間(分)の両方のスケールバーを 、解析>ツール>スケールバー メニューからキモグラフに追加します。 カイモグラフの傾きから微小管の成長速度を測定します(図3A、1-2、黒い線の傾き)。 生成されたカイモグラフから、または利用可能な分析マクロ5、8、18、25を使用して、動的微小管イベント(大惨事または再成長)をカウントする。図3A、1-2の赤い点線は、大惨事/急速な分解イベントを表します。 アクチンのダイナミクスを次のように分析します(図3B)。 アクチン核生成を次のように測定する: 反応開始後100秒後に視野内に存在するアクチンフィラメントの数をカウントし、その面積(フィラメント当たりμm2)で表す。 上記のステップ 8.2.3.1 のように、ROI マネージャーでデータを記録および保存します。 アクチンフィラメント伸長速度を次のように測定します(図3B)。 セグメント化された線ツールを使用して、目的のアクチンフィラメントに沿って線を描画します。 上記のステップ8.2.3.1のようにROIマネージャに行を追加します。 少なくとも4つのムービーフレームについて、次の行(各測定値をROIマネージャに追加する)を繰り返します。注:7〜8フレームの連続したフレームを測定することをお勧めしますが、条件によっては、対物レンズ/顕微鏡の設定で解決できる検出可能な限界を下回るアクチン重合が遅くなることがあります。このような場合、測定は、連続していないフレームにわたって一定の間隔で(例えば、5フレームごとに)行うことができる。 経過時間にわたって測定された長さの値をプロットします。生成された線の傾きは、ミクロン/秒単位のアクチン伸び率である。 ミクロンのフィラメント32中のアクチンモノマーの数を説明するために、370サブユニットの補正係数を用いて、最終的に計算された速度をサブユニットs−1μM−1として搬送する。 平行アクチン-微小管関連(図3C)の領域について、以下のように相関分析を実行します。 直線ツールを使用して、特定の時点(すなわち、反応開始後300秒後)に目的の微小管に沿って線を引く。 上記のステップ8.2.3.1のようにROIマネージャに行を追加します。 各チャンネルの線に沿って蛍光強度をプロットします。 画像スライダーで各チャンネルを選択し、「コマンドk」を使用して線に沿って強度をプロットします。 出力ウィンドウの「リスト」ボタンをクリックして値を保存またはエクスポートします。 アクチン-微小管結合事象を、個々の事象からの比率(微小管と重複するアクチン)として、または一貫した時点での所与の視野内の事象の数として表現する(図3C)。 代替案: ソフトウェアを使用して、両方のチャネルのオーバーラップ率 5,12 を決定します。
Representative Results
上記の条件(図1)により、アクチンおよび微小管ポリマーは、画像取得から2分以内に可視(および動的)になるはずです(図2)。他の生化学ベースのプロトコルと同様に、異なる調節タンパク質またはタンパク質のバッチに対して最適化が必要な場合があります。これらの理由から、TIRF角度と画像露光は、個々のポリマーを含む反応で最初に設定されます。これは、保存されたタンパク質が機能的であり、検出に十分な標識タンパク質が存在することを確認する。必ずしも必要ではない(ここでは実行されない)が、映画の後処理(すなわち、背景減算、平均化、またはフーリエ変換)を使用して、画像コントラスト(特に微小管)を増強することができる5、25、33。このアッセイによってもたらされる単一アクチンフィラメントおよび微小管の直接可視化は、重合パラメータ(すなわち、核生成または伸長速度)、分解パラメータ(すなわち、収縮速度または大惨事事象)、およびポリマーのコアラインメント/オーバーラップを含む、細胞骨格成分単独または一緒にいくつかの動的測定の定量的決定を支持する(図3).さらに、これらの測定は、タウのような調節リガンドの結合または影響を解読するための出発点として使用することができる(図3)。単一のアクチンフィラメントまたは微小管の多くの測定は、1つのTIRFフィルムから行うことができる。ただし、カバースリップコーティング、ピペッティング、およびその他の要因のばらつきにより、信頼性の高い測定には複数の技術的複製反応/ムービーも含める必要があります。 微小管ダイナミクスの多くの側面は、微小管の伸び率、大惨事や救助イベントの頻度など、キモグラフの例から決定することができます(図3A)。このシステムでアクチンダイナミクスを測定するためにキモグラフを使用することは、アクチンフィラメントが微小管よりも複雑であるため、それほど簡単ではありません。その結果、アクチンフィラメントダイナミクスのパラメータは手作業で測定され、時間と労力がかかります。核生成カウントは、すべての条件について一貫した時点で存在するアクチンフィラメントの数として測定される。これらのカウントは、TIRFイメージング分野によって大きく異なりますが、多くの反復で使用したり、他の重合アッセイからの観察を補完するために使用できます。核生成カウントは、試験条件が安定化微小管種子を欠いている場合、微小管にも使用することができる。アクチンフィラメント伸長速度は、少なくとも4つのムービーフレームからの経時的なフィラメントの長さとして測定される。レート値は、ミクロンのフィラメント中のアクチンモノマーの数を説明するために、370サブユニットの補正係数でマイクロモルアクチン当たりに搬送される(図3B)32。アクチンと微小管との間の協調挙動を定義するための測定は、あまり明確に定義されていない。しかし、相関分析は、ラインスキャン(図3C)またはオーバーラップソフトウェア5、11、34を含む両方のポリマーの一致を測定するために適用されている。 データの可用性:この作業に関連するすべてのデータセットはZenodoに寄託されており、10.5281/zenodo.6368327で合理的な要求で入手できます。 図1.実験回路図:フローチャンバアセンブリから画像取得まで。(A)イメージングチャンバアセンブリ。上から下へ:IBIDIイメージングチャンバは、灌流ウェル(矢印で示す)に沿ってテープで固定される。テープバッキングの2番目の(白い)層(ユーザーの向きを良くするために示されている画像では左側)が除去され、エポキシが灌流チャンバの端(矢印)に塗布される。注: エポキシを配置する場所をユーザーにより簡単に指示するために、このイメージでは白いバッキングがオンのままになっています。洗浄およびコーティングされたカバースリップは、コーティング側が灌流ウェルの内側に面して画像化チャンバに取り付けられる。(b)画像化チャンバをビオチン−ストレプトアビジン結合のためにコンディショニングするためのステップを示すフローチャート。(c)動的微小管およびアクチンフィラメントのTIRF膜を取得するために用いられる反応の例。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図2.Tauの非存在下または存在下で増殖するアクチンフィラメントおよび微小管の画像配列。 250 nM Tauの非存在下(A)または存在下(B)において、0.5μMアクチン(10%Alexa-647-アクチンおよび0.09%ビオチン-アクチン標識)および15μM遊離チューブリン(4%HiLyte-488標識)を含むTIRFアッセイからのタイムラプス画像モンタージュ。反応開始からの経過時間(チューブAとチューブBの混合)を示す。スケール バー、25 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図3.微小管およびアクチンフィラメントダイナミクスの測定例。 (A)チューブリンチャネルの平均時間投影は、カイモグラフプロットを生成するために使用されるラインスキャンの微小管総長を効率的に視覚化します。黒い点線は、右に示す動的微小管の2つのキモグラフの例に対応する。微小管の成長段階(実線の黒い線)と分解段階(ピンクの点線、ピンク色の矢印で表記された2本)が各キモグラフに表示されます。タイムスケールバー、3分。長さスケールバー、10μm。反応は、0.5μMアクチン(107標識)および15μM遊離チューブリン(48-HiLyte標識)を含有する。チューブリンチャネルのみが表示されます。(B)活発に重合するシングルアクチンフィラメントを描いた2つの例のタイムラプス画像モンタージュ。伸長率は、マイクロモルアクチン当たりの経時的なアクチンフィラメントの長さのプロットの傾きとして計算される。したがって、1 μM アクチン濃度で典型的に決定される速度の比較のために、2 つの補正係数を 0.5 μM アクチン反応に適用する必要があります。5本のフィラメントの例を右に示す。スケールバー、10μm。反応は、0.5μMアクチン(107標識)および15μM遊離チューブリン(48-HiLyte標識)を含有する。アクチンチャネルのみが表示されます。(c)動的微小管(MT)(緑色)およびアクチンフィラメント(紫色)の非存在下(左)または250nM Tau(中央)の存在下で重合するTIRF画像。青い点線と矢印は、各条件に対応するラインスキャンプロットの線が引かれた場所を示します(各画像の下)。微小管とアクチン領域(黒で表示)の間の重なりは、面積ごとに設定された時点でスコアリングすることができる(右)。スケールバー、25μm。反応には、0.5 μM アクチン (10% 647-標識) および 15 μM 遊離チューブリン (4% 488-HiLyte 標識) が含まれ、250 nM Tau の有無にかかわらず含まれます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
Discussion
可視化された精製タンパク質に全内部反射蛍光(TIRF)顕微鏡を使用することは、細胞骨格調節のユニークなメカニズムを解剖するための実りある説得力のあるアプローチでした5、23、24、25、26、27、35。従来の生化学的アッセイと比較して、TIRF反応は非常に少量(50-100μL)を必要とし、細胞骨格ダイナミクスの定量的測定は個々のアッセイから収集することができる。細胞骨格ダイナミクスのほとんどの研究は、単一のポリマー系(すなわち、アクチンフィラメントまたは微小管)に焦点を当てているため、細胞で典型的に見られるアクチンフィラメントと微小管との間のクロストークまたは創発的挙動の詳細な測定は、とらえどころがなく、試験管内で反復することが困難であった。この問題を解決するために、このプロトコルは、同じ生化学反応における動的アクチンおよび微小管ポリマーの直接可視化を可能にするシングルフィラメントTIRF顕微鏡システムを記述する。したがって、この方法は、アクチンフィラメントまたは微小管のみの動的挙動を再現する従来のアッセイを超えています。この技術は、細胞骨格結合因子の存在下でいくつかの動的特性がどのように変化するかの例としてタウを用いても行われた。このプロトコルは、MACF、GAS、ホルミンなどを含む(ただしこれらに限定されない)アクチンまたは微小管ダイナミクスを調整することが知られている、または疑われる追加のタンパク質と共に使用することができる。最後に、提供されたサンプル分析は、このプロトコルで取得したデータを定量化するためのガイドとして使用できます。
「見ることは信じること」は、顕微鏡ベースのアッセイを実行する説得力のある理由です。しかしながら、TIRF顕微鏡実験の実行および解釈には注意が必要である。細胞骨格共集合アッセイの1つの大きな課題は、一般的に使用される多くのイメージング条件が各ポリマーに適合しないことである。微小管およびアクチンは、典型的には、重合のための異なる緩衝液、温度、塩、ヌクレオチド、および濃度要件を有する。アクチン、チューブリン、目的の調節タンパク質、およびこのプロトコルで利用されるバッファーは、凍結融解サイクルに敏感です。したがって、このプロトコルを正常に実行するには、タンパク質とバッファーの慎重な取り扱いが必要です。これらの懸念の多くを軽減するために、新しくリサイクルされたチューブリン(<6週間凍結)を使用し、超遠心分離による凍結/再懸濁アクチンの事前除去を強く推奨します。これらの考慮事項は、この手順で評価される無数の調節タンパク質にも適用され、凍結融解サイクルまたは緩衝塩の濃度に敏感である可能性がある5、11、36。
残念ながら、実験的なトレードオフのない万能のバッファは存在しません。より低濃度のタンパク質に対してより多くの容量を適切とするために、ATPおよびGTPを2x TIRF緩衝液に含ませてもよい(図1C)。しかし、これらのヌクレオチドは凍結融解サイクルに対して非常に敏感であるため、推奨されません。ここで用いられる脱酸素化合物(カタラーゼおよびグルコースオキシダーゼ)は、タンパク質を長期間(数分から数時間)可視化するために必要であるが、高濃度での微小管重合を制限することが知られている5。これらのバッファーに関する考慮事項に関連して、このプロトコルの限界は、いくつかの標準的な微小管関連調節タンパク質が、微小管のみ(アクチンを含まない)を用いた細胞またはアッセイにおいて見出される機能を再現するために多かれ少なかれ塩を必要とする可能性があることである。これらの懸念に対処するために塩の性質または濃度を変更することは、アクチンフィラメント重合の速度および/または微小管ダイナミクスのパラメータに影響を与える可能性が高い。複数の記述パラメータ(最小、核生成、伸長速度、および安定性)の測定(図3)は、プロトコルの成功を確認したり、特定のバッファーや調節タンパク質の影響を明示的に文書化したりするために必要です。例えば、アクチンフィラメント重合が多すぎると、数秒以内にアクチン-微小管結合イベントが不明瞭になる可能性があります。その結果、アクチンの全体的な濃度を低下させることによる、またはアクチン核形成を抑制するための追加のタンパク質(すなわち、プロフィリン)を含むことによって実験条件を微調整することは、アクチン−微小管活性を協調させる全体的な期間を延長することが明確に見ることができる。これらの前提条件に対処するコントロールと技術的な複製 (複数の視野を超えて) は、ユーザーが信頼性と再現性のある結果を生成するために不可欠です。
細胞ベースの研究は、タンパク質とタンパク質の直接的な関係や調節複合体の作用を観察する機会が限られています。対照的に、in vitroアッセイから収集されたメカニズムのいくつかは、細胞で見られるタンパク質の正確な挙動を必ずしも反映しているとは限らない。この古典的な生化学者のジレンマは、この技術の将来の応用において、特定の修正を加えて対処することができる。例えば、機能的に蛍光標識されたカップリングタンパク質を添加すると、この方法はシングルフィラメント研究から単一分子研究に拡張されます。アッセイは、細胞様現象を再現するために必要な「欠落している」未知の重要な因子を追加する可能性のある細胞抽出物を使用するようにさらに修正することができる。例えば、酵母またはアフリカツメガエル抽出物を用いるTIRFベースのアッセイは、収縮性アクトミオシン環37、有糸分裂紡錘体26、38、アクチンまたは微小管集合体39、40の構成要素、さらにはセントロソームおよびキネトコール36、41、42、43におけるダイナミクスを再構成した。.さらに、そのようなシステムは、脂質またはシグナル伝達因子が存在する人工細胞系への道を開き得る44、45、46。
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Marc Ridilla(Repair Biotechnologies)とBrian Haarer(SUNY Upstate)に、このプロトコルに関する有益なコメントをいただいたことに感謝しています。この研究は、国立衛生研究所(GM133485)の支援を受けた。
Materials
| 1% BSA (w/v) | Fisher Scientific | BP1600-100 | For this purpose (blocking TIRF chambers), BSA is resuspended in ddH20 and filtered through a 0.22 µm filter. |
| 1× BRB80 | Homemade | 80 mM PIPES, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, pH 6.8 with KOH | |
| 10 mg/mL (1000 U) glucose oxidase | Sigma Aldrich Inc, St. Louis, MO | G2133-50KU | Combined with catalase, aliquot and store at -80 oC until use |
| 100 µM tubulin | Cytoskeleton Inc, Denver, CO | T240 | Homemade tubulins should be recycled before use to remove polymerization-incompetent tubulin (Hyman et al. (1992)29; Li and Moore (2020)30). Commercially available tubulins are often too dilute to recycle, but function well if resuspended according to manufacturer’s instructions and pre-cleared via ultracentrifugation (278,000 × g) for 60 min, before use. |
| 100 mM ATP | Gold Biotechnology Inc, Olivette, MO | A-081 | Resuspended in ddH20 (pH 7.5) and filter sterilized. |
| 100 mM GTP | Fisher Scientific | AC226250010 | Resuspended in 1× BRB80 (pH 6.8) and filter sterilized. |
| 120-150 mW solid-state lasers | Leica Microsystems | 11889151; 11889148 | |
| 2 mg/mL catalase | Sigma Aldrich Inc, St. Louis, MO | C40-100 | Combined with glucose oxidase, aliquot and store at -80 oC until use |
| 2× TIRF buffer | Homemade | 2× BRB80, 100 mM KCl, 20 mM DTT, 80 mM glucose, 0.5% (v/v) methylcellulose (4,000 cp); Note: 1 µL of 0.1M GTP and 1 µL of 0.1M ATP added separately to TIRF reactions to avoid repeated freeze-thaw cycles. | |
| 24 × 60 mm, #1.5 coverglass | Fisher Scientific, Waltham, MA | 22-266882 | Coverglass must be extensively washed before use (Smith et al. (2014)22) |
| 37 oC heatblock | |||
| 37 oC water bath | |||
| 5 mg/mL Streptavidin (600x stock) | Avantor, Philadelphia, PA | RLS000-01 | Resuspended in Tris-HCl (pH 8.8); dilute the aliquot to 1× in HEK buffer on day of use |
| 5 min Epoxy resin and hardener | Loctite, Rocky Hill, CT | 1365736 | Combined resin and hardener may take up to 30 min to cure. |
| 50% biotinylated-GpCpp microtubule seeds | Cytoskeleton Inc; Homemade | T333P | (optional) GppCpp or Taxol stabilized microtubule seeds can more efficiently mediate microtubule polymerization. Taxol and GppCpp stabilize microtubules in different ways that can affect the microtubule lattice structure and ability of certain regulatory proteins to bind to the stabilized portion of the microtubule. A method to make diverse kinds of microtubule seeds is outlined in Hyman et al. (1992). |
| 70 oC incubator | |||
| Actin mix stock | Homemade; this protocol | A 12.5 µM actin mix comprised of labeled (fluorescent and biotinylated) and unlabeled actin for up to six reactions. 2 µL of stock is used in the final TIRF reaction. The final concentration of actin used in each reaction is 0.5 µM (10% Alexa-647; 0.09% biotin-labeled). | |
| Appropriate buffer controls | Homemade | Combination of buffers from all proteins being assessed | |
| Biotin-PEG-silane (MW 3,400) | Laysan Bio Inc | biotin-PEG-SIL-3400 | Dispensed into 2-5 mg aliquots, backfilled with nitrogen, parafilmed closed, and stored at -20 oC with desiccant until use |
| Biotinylated actin | Cytoskeleton Inc; Homemade | AB07 | Biotin-actin is made by labeling on lysine residues and thus assumed to be at least 100% labeled, but varies with different lots/preparations. Optimal biotinylated actin concentrations must be empirically determined for particular uses/experimental designs. Higher concentrations permit more efficient tracking, but may impede polymerization or interactions with regulatory proteins. Here a small percentage (0.09% or 900 pM) biotinylated actin is present in the final TIRF reaction. |
| Dishsoap | Dawn, Procter and Gamble, Cincinnati, OH | For unknown reasons, the blue version cleans coverslips more efficiently than other available colors. | |
| Dry ice | |||
| FIJI Software | www.https://imagej.net/software/fiji/downloads | Schneider et al. (2012)31. | |
| Fluorescently labeled actin | Cytoskeleton Inc; Homemade | AR05 | Homemade fluorescently labeled actin is stored in G-buffer supplemented with 50% glycerol at -20 oC (Spudich et al. (1971)47; Liu et al. (2022)48). Fluorescently labeled actin is dialyzed against G-buffer and precleared via ultracentrifugation for 60 min at 278,000 × g before use. |
| Fluorescently labeled tubulin | Cytoskeleton Inc | TL488M, TLA590M, TL670M | Resuspended in 20 µL 1× BRB80 (10 µM final concentration) and pre-cleared via ultracentrifugation (278,000 × g) for 60 min, before use. |
| G-buffer | Homemade | 3 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.2 mM CaCl2, 0.5 mM DTT, 0.2 mM ATP | |
| HEK Buffer | Homemade | 20 mM HEPES (pH 7.5), 1 mM EDTA (pH 8.0), 50 mM KCl | |
| Ice | |||
| Ice bucket | |||
| Imaging chambers | IBIDI, Fitchburg, WI | 80666 | Order chambers with no bottom to utilize different coverslip coatings |
| iXon Life 897 EMCCD camera | Andor, Belfast, Northern Ireland | 8114137 | |
| LASX Premium microscope software | Leica Microsystems | 11640611 | |
| Methylcellulose (4,000 cp) | Sigma Aldrich Inc | M0512 | |
| Microscope base equipped with TIRF module | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | 11889146 | |
| mPEG-silane (MW 2,000) | Laysan Bio Inc, Arab, AL | mPEG-SIL-2000 | Dispensed into 10-15 mg aliquots, backfilled with nitrogen, parafilmed closed, and stored at -20 oC with desiccant until use |
| Objective heater and heated stage insert | OKO labs, Pozzioli, Italy | 8113569 | Set temperature controls to 35-37 oC. Use manufacturer suggestions for accurate calibration. |
| Perfusion pump | Harvard Apparatus, Holliston, MA | 704504 | A syringe and tubing can be substituted. |
| Petri Dish, 100 x 15 mm | Genesee Scientific, San Diego, CA | 32-107 | |
| Plastic slide mailer container | Fisher Scientific | HS15986 | |
| SA-S-1L-SecureSeal 0.12 mm thick | Grace Biolabs, Bend, OR | 620001 | Double-sided tape of precise manufactured dimensions is strongly recommended. |
| Small styrofoam container | Abcam, Cambridge, UK | Reused from shipping | |
| Small weigh boat | Fisher Scientific | 02-202-100 | |
| Spectrophotometer | |||
| Tau | Cytoskeleton Inc | TA01 | Three isoforms of Tau are present in the commercially available preparation of Tau. The concentration in this protocol was determined from the highest molecular weight band (14.3 µM, when resuspended per manufacturer’s recommendations with 50 µL of ddH20). |
| Temperature corrected 63× Plan Apo 1.47 N.A. oil immersion TIRF objective | Leica Microsystems | 11506319 | |
| Tubulin stock | Homemade; this protocol | A tubulin stock consisting of 7.2 µL recycled 100 µM unlabeled tubulin and 3 µL of 10 µM resuspended commercially available fluorescently labeled tubulin. One tubulin stock is used per reaction and thawed/stored on ice. The final concentration of free tubulin in each reaction is 15 µM (4% labeled). More than 15 µM tubulin will result in hyperstabilized (not dynamic) microtubules, whereas concentrations below 7.5 µM free tubulin do not polymerize well. Careful determination of protein concentration and handling is required. | |
| Unlabeled actin (dark) | Cytoskeleton Inc; Homemade | AKL99 | Actin nucleates are almost always present in commercially available (lyophilized) or frozen actins and contribute to variability in quantitative measurements (Spudich et al. (1971)47; Liu et al. (2022)48). Rabbit muscle actin is stored in G-buffer at -80 oC and precleared via ultracentrifugation for 60 min at 278,000 × g before use. Several actin stock solutions are made throughout the day (making no more than enough for six reactions at a time is strongly recommended). |
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