تصور ديناميكيات اقتران الأكتين والأنابيب الدقيقة في المختبر بواسطة المجهر الكلي للتألق الداخلي (TIRF)
Özet
هذا البروتوكول هو دليل لتصور الأكتين الديناميكي والأنابيب الدقيقة باستخدام الفحص المجهري الداخلي الكلي للتألق في المختبر (TIRF).
Abstract
تقليديا ، تمت دراسة الهياكل الخلوية للأكتين والأنابيب الدقيقة ككيانات منفصلة ، تقتصر على مناطق أو عمليات خلوية محددة ، وتنظمها مجموعات مختلفة من البروتينات الملزمة الفريدة لكل بوليمر. تظهر العديد من الدراسات الآن أن ديناميكيات كل من البوليمرات الخلوية الهيكلية متشابكة وأن هذا الحديث المتبادل مطلوب لمعظم السلوكيات الخلوية. تم بالفعل تحديد عدد من البروتينات المشاركة في تفاعلات الأكتين والأنابيب الدقيقة (أي تاو ، MACF ، GAS ، الفورمين ، وأكثر من ذلك) وهي تتميز بشكل جيد فيما يتعلق إما بالأكتين أو الأنابيب الدقيقة وحدها. ومع ذلك ، أظهرت دراسات قليلة نسبيا مقايسات تنسيق الأكتين والأنابيب الدقيقة مع الإصدارات الديناميكية من كلا البوليمرات. وهذا قد يحجب آليات الربط الناشئة بين الأكتين والأنابيب الدقيقة. هنا ، تسمح تقنية إعادة التشكيل في المختبر القائمة على التألق الداخلي الكلي للانعكاس الداخلي (TIRF) بتصور كل من ديناميكيات الأكتين والأنابيب الدقيقة من تفاعل كيميائي حيوي واحد. تحافظ هذه التقنية على ديناميكيات البلمرة إما لخيوط الأكتين أو الأنابيب الدقيقة بشكل فردي أو في وجود البوليمر الآخر. يستخدم بروتين تاو المتوفر تجاريا لتوضيح كيفية تغير سلوكيات الأكتين والأنابيب الدقيقة في وجود بروتين تقليدي متقاطع بين الهيكل الخلوي. يمكن أن توفر هذه الطريقة رؤى وظيفية وميكانيكية موثوقة حول كيفية تنسيق البروتينات التنظيمية الفردية لديناميكيات الأكتين والأنابيب الدقيقة بدقة خيوط مفردة أو مجمعات أعلى مرتبة.
Introduction
تاريخيا، كان ينظر إلى الأكتين والأنابيب الدقيقة على أنهما كيانان منفصلان، لكل منهما مجموعة خاصة به من البروتينات التنظيمية، والسلوكيات الديناميكية، والمواقع الخلوية المتميزة. تظهر الأدلة الوفيرة الآن أن بوليمرات الأكتين والأنابيب الدقيقة تشارك في آليات التداخل الوظيفية الضرورية لتنفيذ العديد من عمليات الخلايا بما في ذلك الهجرة وتحديد موضع المغزل الانقسامي والنقل داخل الخلايا ومورفولوجيا الخلية1،2،3،4. تعتمد السلوكيات المنسقة المتنوعة التي تكمن وراء هذه الأمثلة على توازن معقد بين عوامل الاقتران والإشارات والخصائص الفيزيائية. ومع ذلك ، فإن التفاصيل الجزيئية التي تدعم هذه الآليات لا تزال غير معروفة إلى حد كبير لأن معظم الدراسات تركز على بوليمر هيكلي خلوي واحد في وقتواحد 1،2،5.
الأكتين والأنابيب الدقيقة لا تتفاعل مباشرة6،7،8. يتم التوسط في الديناميكيات المنسقة للأكتين والأنابيب الدقيقة التي شوهدت في الخلايا بواسطة عوامل إضافية. تم تحديد العديد من البروتينات التي يعتقد أنها تنظم الأكتين والأنابيب الدقيقة المتقاطعة وتتميز أنشطتها بشكل جيد فيما يتعلق إما بالبوليمر الخلوي الهيكلي وحده 1,2. تشير الأدلة المتزايدة إلى أن نهج البوليمر الواحد هذا قد أخفى الوظائف المزدوجة لبعض البروتينات / المجمعات التي تمكن أحداث اقتران الأكتين والأنابيب الدقيقة7،8،9،10،11،12،13. التجارب التي يوجد فيها كلا البوليمرات نادرة وغالبا ما تحدد الآليات ذات البوليمر الديناميكي الواحد والنسخة المستقرة الثابتة من 6,8,9,10,11,14,15,16,17,18 الأخرى . وبالتالي ، هناك حاجة إلى طرق للتحقيق في الخصائص الناشئة للبروتينات المنسقة بين الأكتين والأنابيب الدقيقة التي قد لا تكون مفهومة تماما إلا في الأنظمة التجريبية التي تستخدم كلا البوليمرات الديناميكية.
تم تطبيق مزيج من أساليب وضع العلامات المباشرة على البروتين ، وعلامات التقارب المشفرة وراثيا ، والفحص المجهري الكلي للتألق الداخلي للانعكاس (TIRF) بنجاح كبير في أنظمة إعادة التشكيل الحيوي19،20،21،22،23. لا تحتوي العديد من المخططات من أسفل إلى أعلى على جميع العوامل التي تنظم البروتينات في الخلايا. ومع ذلك ، فإن تقنية “الكيمياء الحيوية على غطاء زجاجي” قد صقلت العديد من آليات ديناميكيات الأكتين والأنابيب الدقيقة على نطاقات مكانية وزمنية عالية ، بما في ذلك المكونات اللازمة لتجميع البوليمر أو تفكيكه ، وحركة بروتين المحرك5،12،23،24،25،26،27 . هنا يتم وصف نهج الحد الأدنى من المكون أحادي الخيط للتحقيق في اقتران الأكتين والأنابيب الدقيقة في المختبر. يمكن استخدام هذا البروتوكول مع البروتينات المتاحة تجاريا أو النقية للغاية ، والبروتينات ذات العلامات الفلورية ، وغرف التروية ، وتوسيعها إلى مخططات أكثر تعقيدا تحتوي على مستخلصات خلوية أو أنظمة اصطناعية. هنا ، يتم استخدام بروتين تاو المتاح تجاريا لتوضيح كيفية تغير ديناميكيات الهيكل الخلوي في وجود بروتين اقتران الأكتين والأنابيب الدقيقة ، ولكن يمكن استبداله بعوامل تنسيق الأكتين والأنابيب الدقيقة المفترضة الأخرى. الميزة الرئيسية لهذا النظام على النهج الأخرى هي القدرة على مراقبة ديناميكيات البوليمرات الخلوية الهيكلية المتعددة في وقت واحد في تفاعل واحد. كما يوفر هذا البروتوكول للمستخدمين أمثلة وأدوات بسيطة لتحديد التغيرات التي تطرأ على البوليمرات الهيكلية الخلوية. وبالتالي ، سينتج مستخدمو البروتوكول بيانات موثوقة وكمية وذات دقة أحادية الخيط لوصف الآليات التي تكمن وراء كيفية تنسيق البروتينات التنظيمية المتنوعة لديناميكيات الأكتين والأنابيب الدقيقة.
Protocol
Representative Results
Discussion
كان استخدام المجهر الفلوري للانعكاس الداخلي الكلي (TIRF) للبروتينات النقية المرئية نهجا مثمرا ومقنعا لتشريح الآليات الفريدة لتنظيم الهيكل الخلوي5،23،24،25،26،27،35. بالمقارنة مع المقايسات الكيميائية الحيوية التقليدية ، تتطلب تفاعلات TIRF كميات صغيرة جدا (50-100 ميكرولتر) ، ويمكن الحصول على قياسات كمية لديناميكيات الهيكل الخلوي من فحص فردي. تركز معظم دراسات ديناميكيات الهيكل الخلوي على نظام بوليمر واحد (أي خيوط الأكتين أو الأنابيب الدقيقة) ، وبالتالي ظلت القياسات التفصيلية للحديث المتبادل أو السلوكيات الناشئة بين خيوط الأكتين والأنابيب الدقيقة التي تظهر عادة في الخلايا بعيدة المنال ويصعب تلخيصها في أنبوب الاختبار. لحل هذه المشكلة ، يصف هذا البروتوكول نظام الفحص المجهري TIRF أحادي الخيط الذي يتيح التصور المباشر للأكتين الديناميكي وبوليمرات الأنابيب الدقيقة في نفس التفاعل الكيميائي الحيوي. وبالتالي ، فإن هذه الطريقة تتجاوز الفحوصات التقليدية التي تلخص السلوك الديناميكي لخيوط الأكتين أو الأنابيب الدقيقة وحدها. تم تنفيذ هذه التقنية أيضا مع تاو كمثال على كيفية تغير العديد من الخصائص الديناميكية في وجود عامل اقتران الهيكل الخلوي. يمكن استخدام هذا البروتوكول مع بروتينات إضافية معروفة أو يشتبه في أنها تنسق ديناميكيات الأكتين أو الأنابيب الدقيقة ، بما في ذلك (على سبيل المثال لا الحصر) MACF و GAS و formins والمزيد. وأخيرا، يمكن استخدام التحليلات المقدمة كدليل لتحديد كمية البيانات التي تم الحصول عليها باستخدام هذا البروتوكول.
“الرؤية هي الإيمان” هو سبب مقنع لإجراء الفحوصات القائمة على الفحص المجهري. ومع ذلك ، يلزم توخي الحذر في تنفيذ وتفسير تجارب الفحص المجهري TIRF. أحد التحديات الرئيسية لاختبارات التجميع المشترك للهيكل الخلوي هو أن العديد من ظروف التصوير الشائعة الاستخدام غير متوافقة مع كل بوليمر. عادة ما يكون للأنابيب الدقيقة والأكتين متطلبات مختلفة للعازل ودرجة الحرارة والملح والنيوكليوتيد والتركيز للبلمرة. الأكتين ، التوبولين ، البروتينات التنظيمية ذات الأهمية ، والمخازن المؤقتة المستخدمة في هذا البروتوكول حساسة لدورات التجميد والذوبان. لذلك ، من الضروري التعامل الدقيق مع البروتينات والمخازن المؤقتة لتنفيذ هذا البروتوكول بنجاح. للتخفيف من العديد من هذه المخاوف ، يوصى بشدة باستخدام توبولين معاد تدويره حديثا (مجمد لمدة <6 أسابيع) ، وإزالة الأكتينات المجمدة / المعاد تعليقها مسبقا عن طريق الطرد المركزي الفائق. تنطبق هذه الاعتبارات أيضا على عدد لا يحصى من البروتينات التنظيمية التي سيتم تقييمها باستخدام هذا الإجراء ، والتي قد تكون حساسة لدورات التجميد والذوبان أو تركيز الأملاح العازلة 5,11,36.
لسوء الحظ ، لا يوجد مخزن مؤقت واحد يناسب الجميع دون مقايضات تجريبية. لتخصيص المزيد من الحجم للبروتينات ذات التركيز المنخفض ، يمكن تضمين ATP و GTP في محلول المخزن المؤقت 2x TIRF (الشكل 1C). ومع ذلك ، نظرا لأن هذه النيوكليوتيدات حساسة للغاية لدورات التجميد والذوبان ، فلا ينصح بذلك. مركبات كسح الأكسجين المستخدمة هنا (أي الكاتالاز والجلوكوز أوكسيديز) ضرورية لتصور البروتينات لفترات طويلة من الزمن (دقائق إلى ساعات) ، ولكن من المعروف أنها تقيد بلمرة الأنابيب الدقيقة بتركيزات عالية5. فيما يتعلق بهذه الاعتبارات العازلة ، فإن أحد قيود هذا البروتوكول هو أن بعض البروتينات التنظيمية الأساسية المرتبطة بالأنابيب الدقيقة قد تتطلب ملحا أكثر أو أقل لتلخيص الوظائف الموجودة في الخلايا أو المقايسات باستخدام الأنابيب الدقيقة وحدها (بدون الأكتين). ومن المرجح أن يؤثر تغيير طبيعة الملح أو تركيزه لمعالجة هذه الشواغل على معدلات بلمرة خيوط الأكتين و/أو بارامترات ديناميات الأنابيب الدقيقة. مطلوب قياسات المعلمات الوصفية المتعددة (الحد الأدنى ، النوى ، معدلات الاستطالة ، والاستقرار) (الشكل 3) لتأكيد نجاح البروتوكول أو لتوثيق آثار المخازن المؤقتة المحددة أو البروتينات التنظيمية صراحة. على سبيل المثال ، يمكن أن يؤدي الكثير من بلمرة خيوط الأكتين إلى حجب أحداث اقتران الأكتين والأنابيب الدقيقة في غضون ثوان. وبالتالي ، فإن ضبط الظروف التجريبية عن طريق خفض التركيز الكلي للأكتين أو تضمين بروتينات إضافية لقمع نواة الأكتين (أي البروفيلين) سيمدد الفترة الإجمالية التي يمكن فيها رؤية أنشطة الأكتين – الأنابيب الدقيقة المنسقة بوضوح. تعد عناصر التحكم التي تتناول هذه المتطلبات الأساسية ، والتكرارات التقنية (خارج مجالات الرؤية المتعددة) ، أمرا بالغ الأهمية للمستخدمين لإنشاء نتائج موثوقة وقابلة للتكرار.
توفر الدراسات القائمة على الخلايا فرصة محدودة لمراقبة العلاقات المباشرة بين البروتين والبروتين أو عمل المجمعات التنظيمية. في المقابل ، فإن بعض الآليات المستقاة من الفحوصات المخبرية لا تعكس دائما السلوكيات الدقيقة للبروتينات التي شوهدت في الخلايا. يمكن معالجة هذه المعضلة الكلاسيكية في الكيمياء الحيوية في التطبيقات المستقبلية لهذه التقنية مع تعديلات محددة. على سبيل المثال ، تؤدي إضافة بروتينات اقتران وظيفية تحمل علامات الفلورسنت إلى توسيع هذه الطريقة من دراسات الخيوط المفردة إلى دراسات الجزيء الواحد. يمكن تعديل المقايسات بشكل أكبر لاستخدام مستخلصات الخلايا التي قد تضيف العوامل الرئيسية غير المعروفة “المفقودة” المطلوبة لتلخيص الظواهر الشبيهة بالخلايا. على سبيل المثال ، أعادت الفحوصات المستندة إلى TIRF باستخدام مستخلصات الخميرة أو Xenopus تشكيل حلقات الأكتوميوزين الانقباضية37 ، والمغزل الانقسامي 26,38 ، ومكونات تجميع الأكتين أو الأنابيب الدقيقة 39,40 ، وحتى الديناميكيات في السنتروسوم و kinetochores 36,41,42,43 . علاوة على ذلك ، قد تمهد هذه الأنظمة الطريق نحو أنظمة الخلايا الاصطناعية التي تحتوي على دهون أو عوامل إشارات موجودة44،45،46.
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
أنا ممتن لمارك ريديلا (إصلاح التقنيات الحيوية) وبراين هارر (جامعة ولاية نيويورك أبستيت) لتعليقاتهم المفيدة على هذا البروتوكول. تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (GM133485).
Materials
| 1% BSA (w/v) | Fisher Scientific | BP1600-100 | For this purpose (blocking TIRF chambers), BSA is resuspended in ddH20 and filtered through a 0.22 µm filter. |
| 1× BRB80 | Homemade | 80 mM PIPES, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, pH 6.8 with KOH | |
| 10 mg/mL (1000 U) glucose oxidase | Sigma Aldrich Inc, St. Louis, MO | G2133-50KU | Combined with catalase, aliquot and store at -80 oC until use |
| 100 µM tubulin | Cytoskeleton Inc, Denver, CO | T240 | Homemade tubulins should be recycled before use to remove polymerization-incompetent tubulin (Hyman et al. (1992)29; Li and Moore (2020)30). Commercially available tubulins are often too dilute to recycle, but function well if resuspended according to manufacturer’s instructions and pre-cleared via ultracentrifugation (278,000 × g) for 60 min, before use. |
| 100 mM ATP | Gold Biotechnology Inc, Olivette, MO | A-081 | Resuspended in ddH20 (pH 7.5) and filter sterilized. |
| 100 mM GTP | Fisher Scientific | AC226250010 | Resuspended in 1× BRB80 (pH 6.8) and filter sterilized. |
| 120-150 mW solid-state lasers | Leica Microsystems | 11889151; 11889148 | |
| 2 mg/mL catalase | Sigma Aldrich Inc, St. Louis, MO | C40-100 | Combined with glucose oxidase, aliquot and store at -80 oC until use |
| 2× TIRF buffer | Homemade | 2× BRB80, 100 mM KCl, 20 mM DTT, 80 mM glucose, 0.5% (v/v) methylcellulose (4,000 cp); Note: 1 µL of 0.1M GTP and 1 µL of 0.1M ATP added separately to TIRF reactions to avoid repeated freeze-thaw cycles. | |
| 24 × 60 mm, #1.5 coverglass | Fisher Scientific, Waltham, MA | 22-266882 | Coverglass must be extensively washed before use (Smith et al. (2014)22) |
| 37 oC heatblock | |||
| 37 oC water bath | |||
| 5 mg/mL Streptavidin (600x stock) | Avantor, Philadelphia, PA | RLS000-01 | Resuspended in Tris-HCl (pH 8.8); dilute the aliquot to 1× in HEK buffer on day of use |
| 5 min Epoxy resin and hardener | Loctite, Rocky Hill, CT | 1365736 | Combined resin and hardener may take up to 30 min to cure. |
| 50% biotinylated-GpCpp microtubule seeds | Cytoskeleton Inc; Homemade | T333P | (optional) GppCpp or Taxol stabilized microtubule seeds can more efficiently mediate microtubule polymerization. Taxol and GppCpp stabilize microtubules in different ways that can affect the microtubule lattice structure and ability of certain regulatory proteins to bind to the stabilized portion of the microtubule. A method to make diverse kinds of microtubule seeds is outlined in Hyman et al. (1992). |
| 70 oC incubator | |||
| Actin mix stock | Homemade; this protocol | A 12.5 µM actin mix comprised of labeled (fluorescent and biotinylated) and unlabeled actin for up to six reactions. 2 µL of stock is used in the final TIRF reaction. The final concentration of actin used in each reaction is 0.5 µM (10% Alexa-647; 0.09% biotin-labeled). | |
| Appropriate buffer controls | Homemade | Combination of buffers from all proteins being assessed | |
| Biotin-PEG-silane (MW 3,400) | Laysan Bio Inc | biotin-PEG-SIL-3400 | Dispensed into 2-5 mg aliquots, backfilled with nitrogen, parafilmed closed, and stored at -20 oC with desiccant until use |
| Biotinylated actin | Cytoskeleton Inc; Homemade | AB07 | Biotin-actin is made by labeling on lysine residues and thus assumed to be at least 100% labeled, but varies with different lots/preparations. Optimal biotinylated actin concentrations must be empirically determined for particular uses/experimental designs. Higher concentrations permit more efficient tracking, but may impede polymerization or interactions with regulatory proteins. Here a small percentage (0.09% or 900 pM) biotinylated actin is present in the final TIRF reaction. |
| Dishsoap | Dawn, Procter and Gamble, Cincinnati, OH | For unknown reasons, the blue version cleans coverslips more efficiently than other available colors. | |
| Dry ice | |||
| FIJI Software | www.https://imagej.net/software/fiji/downloads | Schneider et al. (2012)31. | |
| Fluorescently labeled actin | Cytoskeleton Inc; Homemade | AR05 | Homemade fluorescently labeled actin is stored in G-buffer supplemented with 50% glycerol at -20 oC (Spudich et al. (1971)47; Liu et al. (2022)48). Fluorescently labeled actin is dialyzed against G-buffer and precleared via ultracentrifugation for 60 min at 278,000 × g before use. |
| Fluorescently labeled tubulin | Cytoskeleton Inc | TL488M, TLA590M, TL670M | Resuspended in 20 µL 1× BRB80 (10 µM final concentration) and pre-cleared via ultracentrifugation (278,000 × g) for 60 min, before use. |
| G-buffer | Homemade | 3 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.2 mM CaCl2, 0.5 mM DTT, 0.2 mM ATP | |
| HEK Buffer | Homemade | 20 mM HEPES (pH 7.5), 1 mM EDTA (pH 8.0), 50 mM KCl | |
| Ice | |||
| Ice bucket | |||
| Imaging chambers | IBIDI, Fitchburg, WI | 80666 | Order chambers with no bottom to utilize different coverslip coatings |
| iXon Life 897 EMCCD camera | Andor, Belfast, Northern Ireland | 8114137 | |
| LASX Premium microscope software | Leica Microsystems | 11640611 | |
| Methylcellulose (4,000 cp) | Sigma Aldrich Inc | M0512 | |
| Microscope base equipped with TIRF module | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | 11889146 | |
| mPEG-silane (MW 2,000) | Laysan Bio Inc, Arab, AL | mPEG-SIL-2000 | Dispensed into 10-15 mg aliquots, backfilled with nitrogen, parafilmed closed, and stored at -20 oC with desiccant until use |
| Objective heater and heated stage insert | OKO labs, Pozzioli, Italy | 8113569 | Set temperature controls to 35-37 oC. Use manufacturer suggestions for accurate calibration. |
| Perfusion pump | Harvard Apparatus, Holliston, MA | 704504 | A syringe and tubing can be substituted. |
| Petri Dish, 100 x 15 mm | Genesee Scientific, San Diego, CA | 32-107 | |
| Plastic slide mailer container | Fisher Scientific | HS15986 | |
| SA-S-1L-SecureSeal 0.12 mm thick | Grace Biolabs, Bend, OR | 620001 | Double-sided tape of precise manufactured dimensions is strongly recommended. |
| Small styrofoam container | Abcam, Cambridge, UK | Reused from shipping | |
| Small weigh boat | Fisher Scientific | 02-202-100 | |
| Spectrophotometer | |||
| Tau | Cytoskeleton Inc | TA01 | Three isoforms of Tau are present in the commercially available preparation of Tau. The concentration in this protocol was determined from the highest molecular weight band (14.3 µM, when resuspended per manufacturer’s recommendations with 50 µL of ddH20). |
| Temperature corrected 63× Plan Apo 1.47 N.A. oil immersion TIRF objective | Leica Microsystems | 11506319 | |
| Tubulin stock | Homemade; this protocol | A tubulin stock consisting of 7.2 µL recycled 100 µM unlabeled tubulin and 3 µL of 10 µM resuspended commercially available fluorescently labeled tubulin. One tubulin stock is used per reaction and thawed/stored on ice. The final concentration of free tubulin in each reaction is 15 µM (4% labeled). More than 15 µM tubulin will result in hyperstabilized (not dynamic) microtubules, whereas concentrations below 7.5 µM free tubulin do not polymerize well. Careful determination of protein concentration and handling is required. | |
| Unlabeled actin (dark) | Cytoskeleton Inc; Homemade | AKL99 | Actin nucleates are almost always present in commercially available (lyophilized) or frozen actins and contribute to variability in quantitative measurements (Spudich et al. (1971)47; Liu et al. (2022)48). Rabbit muscle actin is stored in G-buffer at -80 oC and precleared via ultracentrifugation for 60 min at 278,000 × g before use. Several actin stock solutions are made throughout the day (making no more than enough for six reactions at a time is strongly recommended). |
Referanslar
- Pimm, M. L., Henty-Ridilla, J. L. New twists in actin-microtubule interactions. Molecular Biology of the Cell. 32 (3), 211-217 (2021).
- Dogterom, M., Koenderink, G. H. Actin-microtubule crosstalk in cell biology. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 20 (1), 38-54 (2019).
- Etienne-Manneville, S. Actin and microtubules in cell motility: which one is in control. Traffic. 5 (7), 470-477 (2004).
- Rodriguez, O. C., et al. Conserved microtubule-actin interactions in cell movement and morphogenesis. Nature Cell Biology. 5 (7), 599-609 (2003).
- Prezel, E., et al. TIRF assays for real-time observation of microtubules and actin coassembly: Deciphering tau effects on microtubule/actin interplay. Methods in Cell Biology. 141, 199-214 (2017).
- Griffith, L. M., Pollard, T. D. The interaction of actin filaments with microtubules and microtubule-associated proteins. The Journal of Biological Chemistry. 257 (15), 9143-9151 (1982).
- Henty-Ridilla, J. L., Rankova, A., Eskin, J. A., Kenny, K., Goode, B. L. Accelerated actin filament polymerization from microtubule plus ends. Science. 352 (6288), 1004 (2016).
- Elie, A., et al. Tau co-organizes dynamic microtubule and actin networks. Scientific Reports. 5 (1), 1-10 (2015).
- Preciado López, M., et al. Actin-microtubule coordination at growing microtubule ends. Nature Communications. 5 (1), 1-9 (2014).
- Oberhofer, A., et al. Molecular underpinnings of cytoskeletal cross-talk. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (8), 3944-3952 (2020).
- Nakos, K., et al. Septins mediate a microtubule-actin crosstalk that enables actin growth on microtubules. bioRxiv. , (2022).
- Kučera, O., Gaillard, J., Guérin, C., Théry, M., Blanchoin, L. Actin-microtubule dynamic composite forms responsive active matter with memory. bioRxiv. , (2022).
- Kundu, T., Dutta, P., Nagar, D., Maiti, S., Ghose, A. Coupling of dynamic microtubules to F-actin by Fmn2 regulates chemotaxis of neuronal growth cones. Journal of Cell Science. 134 (13), 252916 (2021).
- Roth-Johnson, E. A., Vizcarra, C. L., Bois, J. S., Quinlan, M. E. Interaction between microtubules and the Drosophila formin Cappuccino and its effect on actin assembly. The Journal of Biological Chemistry. 289 (7), 4395-4404 (2014).
- Gaillard, J., et al. Differential interactions of the formins INF2, mDia1, and mDia2 with microtubules. Molecular Biology of the Cell. 22 (23), 4575-4587 (2011).
- Bartolini, F., et al. The formin mDia2 stabilizes microtubules independently of its actin nucleation activity. The Journal of Cell Biology. 181 (3), 523-536 (2008).
- Sider, J. R., et al. Direct observation of microtubule-F-actin interaction in cell free lysates. Journal of Cell Science. 112 (12), 1947-1956 (1999).
- Alkemade, C., et al. Cross-linkers at growing microtubule ends generate forces that drive actin transport. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (11), 2112799119 (2022).
- Axelrod, D. Total internal reflection fluorescence microscopy in cell biology. Methods in Enzymology. 361, 1-33 (2003).
- Amann, K. J., Pollard, T. D. Direct real-time observation of actin filament branching mediated by Arp2/3 complex using total internal reflection fluorescence microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (26), 15009-15013 (2001).
- Al-Bassam, J. Reconstituting dynamic microtubule polymerization regulation by TOG domain proteins. Methods in Enzymology. 540, 131-148 (2014).
- Smith, B. A., Gelles, J., Goode, B. L. Single-molecule studies of actin assembly and disassembly factors. Methods in Enzymology. 540, 95-117 (2014).
- Wioland, H., Jégou, A., Romet-Lemonne, G. Celebrating 20 years of live single-actin-filament studies with five golden rules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (3), 2109506119 (2022).
- Ganzinger, K. A., Schwille, P. More from less – bottom-up reconstitution of cell biology. Journal of Cell Science. 132 (4), (2019).
- Mahamdeh, M., Howard, J. Implementation of interference reflection microscopy for label-free, high-speed imaging of microtubules. Journal of Visualized Experiments. (150), e59520 (2019).
- King, M. R., Petry, S. Phase separation of TPX2 enhances and spatially coordinates microtubule nucleation. Nature Communications. 11 (1), 270 (2020).
- Ramirez-Rios, S., et al. A TIRF microscopy assay to decode how tau regulates EB’s tracking at microtubule ends. Methods in Cell Biology. 141, 179-197 (2017).
- Smith, B. A., et al. Three-color single molecule imaging shows WASP detachment from Arp2/3 complex triggers actin filament branch formation. eLife. 2, 01008 (2013).
- Hyman, A. A., Salser, S., Drechsel, D. N., Unwin, N., Mitchison, T. J. Role of GTP hydrolysis in microtubule dynamics: information from a slowly hydrolyzable analogue GMPCPP. Molecular Biology of the Cell. 3 (10), 1155-1167 (1992).
- Li, G., Moore, J. K. Microtubule dynamics at low temperature: evidence that tubulin recycling limits assembly. Molecular Biology of the Cell. 31 (11), 1154-1166 (2020).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Pollard, T. D., Blanchoin, L., Mullins, R. D. Molecular mechanisms controlling actin filament dynamics in nonmuscle cells. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 29, 545-576 (2000).
- Kapoor, V., Hirst, W. G., Hentschel, C., Preibisch, S., Reber, S. MTrack: Automated detection, tracking, and analysis of dynamic microtubules. Scientific Reports. 9 (1), 3794 (2019).
- Willige, D., et al. Cytolinker Gas2L1 regulates axon morphology through microtubule-modulated actin stabilization. EMBO reports. 20 (11), (2019).
- Hirst, W. G., Kiefer, C., Abdosamadi, M. K., Schäffer, E., Reber, S. In vitro reconstitution and imaging of microtubule dynamics by fluorescence and label-free microscopy. STAR Protocols. 1 (3), 100177 (2020).
- Farina, F., et al. The centrosome is an actin-organizing centre. Nature Cell Biology. 18 (1), 65-75 (2016).
- Mishra, M., et al. In vitro contraction of cytokinetic ring depends on myosin II but not on actin dynamics. Nature Cell Biology. 15 (7), 853-859 (2013).
- Groen, A. C., Ngyuen, P. A., Field, C. M., Ishihara, K., Mitchison, T. J. Glycogen-supplemented mitotic cytosol for analyzing Xenopus egg microtubule organization. Methods in Enzymology. 540, 417-433 (2014).
- Pollard, L. W., Garabedian, M. V., Alioto, S. L., Shekhar, S., Goode, B. L. Genetically inspired in vitro reconstitution of Saccharomyces cerevisiae actin cables from seven purified proteins. Molecular Biology of the Cell. 31 (5), 335-347 (2020).
- Bergman, Z. J., Wong, J., Drubin, D. G., Barnes, G. Microtubule dynamics regulation reconstituted in budding yeast lysates. Journal of Cell Science. 132 (4), 219386 (2018).
- Inoue, D., et al. Actin filaments regulate microtubule growth at the centrosome. The EMBO Journal. 38 (11), (2019).
- Colin, A., Singaravelu, P., Théry, M., Blanchoin, L., Gueroui, Z. Actin-network architecture regulates microtubule dynamics. Current Biology. 28 (16), 2647-2656 (2018).
- Torvi, J. R., et al. Reconstitution of kinetochore and microtubule dynamics reveals a role for a kinesin-8 in establishing end-on attachments. bioRxiv. , (2022).
- Nguyen, P. A., et al. Spatial organization of cytokinesis signaling reconstituted in a cell-free system. Science. 346 (6206), 244-247 (2014).
- Abu Shah, E., Keren, K. Symmetry breaking in reconstituted actin cortices. eLife. 3, 01433 (2014).
- Vendel, K. J. A., Alkemade, C., Andrea, N., Koenderink, G. H., Dogterom, M. In vitro reconstitution of dynamic co-organization of microtubules and actin filaments in emulsion droplets. Cytoskeleton Dynamics. 2101, 53-75 (2020).
- Spudich, J. A., Watt, S. The regulation of rabbit skeletal muscle contraction. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin. The Journal of Biological Chemistry. 246 (15), 4866-4871 (1971).
- Liu, X., Pimm, M. L., Haarer, B., Brawner, A. T., Henty-Ridilla, J. L. Biochemical characterization of actin assembly mechanisms with ALS-associated profilin variants. European Journal of Cell Biology. 101 (2), 151212 (2022).
- Pimm, M. L., Liu, X., Tuli, F., Lojko, A., Henty-Ridilla, J. L. Visualizing functional human profilin in cells and in vitro applications. bioRxiv. , (2021).
