Uso della bisezione per ridurre il DNA mitocondriale nell'ovocita bovino

Il trasferimento nucleare di cellule somatiche (SCNT) include la fusione di un ovocita enucleato da un animale e una cellula somatica da un animale della stessa specie. Nella maggior parte dei casi, l’ovocita e la cellula somatica provengono dalla stessa specie e i tassi di natalità vivi sono inferiori al 6%¹. Alcune ricerche prevedono l’uso di SCNT interspecie (iSCNT), che include la fusione di una cellula somatica e di un ovocita che provengono da due specie diverse. In questi studi, i tassi di natalità vivi sono ancora più bassi rispetto a SCNT, in genere inferiori all’1%¹. Tuttavia, iSCNT ha la capacità di essere utilizzato come metodo per salvare le specie in via di estinzione, poiché le cellule somatiche di questi animali sono più accessibili delle loro cellule germinali¹. Gli ovociti riceventi utilizzati in iSCNT sono spesso specie domestiche o di laboratorio comuni, come mucche, maiali e topi. Alcuni tentativi fatti finora hanno prodotto con successo giovani vivi, sebbene la prole prodotta sia stata costituita da animali intragenerici (le specie di ovociti riceventi e le specie di cellule donatrici erano membri dello stesso genere)^2,3,4. I modelli intergenerici (che utilizzano un ovocita e una cellula somatica di animali di generi diversi) non hanno ancora prodotto animali vivi e la maggior parte degli embrioni ricostruiti arresta allo stadio di 8-16 cellule dello sviluppo in vitro 5,6,7,8. Una possibile spiegazione di questo arresto dello sviluppo embrionale è l’insorgenza di eteroplasmia mitocondriale negli embrioni, la presenza di più di un tipo di DNA mitocondriale (mtDNA) in una singola cellula. L’eteroplasmia può portare a problemi come l’inefficienza dello sviluppo o il fallimento nell’embrione o nell’animale vivo¹. La patogenesi può anche verificarsi più tardi nel corso della vita dell’animale⁹. Sebbene questo problema sia presente anche nella prole SCNT, la componente interspecifica all’interno degli embrioni iSCNT aggrava il problema.

Quando il mtDNA embrionale proviene da due specie diverse, i mitocondri ovocitari riceventi, che rappresentano la maggioranza, non funzionano in modo efficiente o efficace con il nucleo^1,10 della cellula donatrice. Maggiori lacune tassonomiche tra le due specie utilizzate in iSCNT probabilmente intensificano questo problema; la prole viva intragenerica prodotta (bos gaurus e bos indicus che utilizza ovociti Bos taurus), così come la prole prodotta tramite SCNT tradizionale (ad esempio la prole Ovis aries che utilizza ovociti Ovis aries) si sono dimostrate chimere (mtDNA di due individui era presente in questi animali 11,12,13). Tuttavia, si sono sviluppati molto più lontano degli embrioni SCNT intergenerici^14,15. Lo scambio di informazioni tra i mitocondri ovocitari e il nucleo della cellula donatrice potrebbe avere più successo nell’embrione intragenerico che nell’embrione intergenerico¹⁶.

La quantità di mtDNA in un ovocita bovino maturo è circa 100 volte maggiore della quantità trovata in una cellula somatica¹². Ridurre questo rapporto potrebbe incoraggiare i mitocondri delle cellule somatiche a proliferare all’interno dell’embrione ricostruito, consentendo a una maggiore popolazione di mitocondri produttivi di essere presente¹⁶. Questo potrebbe a sua volta fornire più energia per soddisfare i requisiti dell’embrione in via di sviluppo¹⁵. I precedenti tentativi fatti per ridurre il numero di copie del mtDNA dell’ovocita o dell’embrione includono l’applicazione chimica, la micromanipolazione e l’integrazione dell’ovocita o dell’embrione con mitocondri aggiuntivi della specie cellulare donatrice 16,17,18,19,20. Tuttavia, l’applicazione chimica (come la 2′,3′-dideossicitidina) non è ideale per lo sviluppo embrionale e ha ridotto il numero di copie di mtDNA degli ovociti di circa la metà¹⁸. La precedente riduzione del mtDNA ovocitario mediante micromanipolazione ha rimosso solo una media del 64% del mtDNA¹⁷ dell’ovocita. Sebbene l’integrazione di mitocondri di cellule donatrici possa essere un’opzione praticabile, il suo uso non ha ancora prodotto un animale intergenerico vivo all’interno degli studi iSCNT²¹.

L’uso della bisezione per ridurre il numero di copie di mtDNA degli ovociti non è stato ancora utilizzato negli studi pubblicati. La bisecting degli ovociti con l’intenzione di fondere gli ooplasti con una cellula somatica è la premessa della clonazione fatta a mano (HMC), che in genere utilizza la bisezione come metodo per rimuovere il corpo polare e la piastra di metafase dall’ovocita della metafase II (MII). HMC ha prodotto con successo prole in diverse specie, tra cui capre, bovini, suini, pecore e cavalli ^{22,23,24,25,26}, ma in genere non include una fase di centrifugazione prima della bisezione. L’integrazione della centrifugazione ad alta velocità dell’ovocita consente l’isolamento dei mitocondri (e quindi del mtDNA) in un polo dell’ovocita, che può quindi essere diviso in due utilizzando una microlama per rimuovere quelle frazioni densamente denshe di mitocondri. Due ooplasti impoveriti di mitocondri possono quindi essere fusi con una cellula somatica, come nel caso dell’HMC, per formare un embrione ricostruito che contiene molto meno mtDNA delle specie ovocitarie.

La domanda a cui tentiamo di rispondere con questo protocollo è come ridurre il mtDNA nell’ovocita bovino al fine di produrre un embrione ricostruito vitale che contenga meno mtDNA eteroplasmatico. In questo protocollo, gli ovociti sono stati centrifugati e tagliati in due. I numeri di copie di ooplast e mtDNA di ovociti intatti sono stati calcolati per determinare l’efficacia di questa tecnica nel ridurre il numero di copie di mtDNA dell’ovocita bovino.