使用二分法减少牛卵母细胞中的线粒体DNA

体细胞核转移（SCNT）包括来自一只动物的去核卵母细胞和来自同一物种动物的体细胞的融合。在大多数情况下，卵母细胞和体细胞起源于同一物种，活产率低于6%¹。一些研究涉及使用种间SCNT（iSCNT），其中包括来自两个不同物种的体细胞和卵母细胞的融合。在这些研究中，活产率甚至低于SCNT，通常低于1%¹。然而，iSCNT有能力用作拯救濒危物种的方法，因为这些动物的体细胞比它们的生殖细胞更容易获得¹。iSCNT中使用的受体卵母细胞通常是家用或常见的实验室物种，如牛，猪和小鼠。到目前为止，一些尝试已经成功地生产出活的幼崽，尽管产生的后代是属内动物（受体卵母细胞物种和供体细胞物种是同一属的成员）^2，3，4。属间模型（利用来自不同属动物的卵母细胞和体细胞）尚未产生活体动物，大多数重建的胚胎在体外^发育的8-16细胞阶段停止5^，6，7，8。这种胚胎发育停滞的一种可能的解释是胚胎中线粒体异质体的发生 – 单个细胞中存在一种以上的线粒体DNA（mtDNA）类型。异型增生术可导致胚胎或活体动物发育效率低下或失败等问题¹。发病机制也可能发生在动物生命的后期⁹.虽然这个问题也存在于SCNT后代中，但iSCNT胚胎中的种间成分加剧了这个问题。

当胚胎mtDNA来自两个不同的物种时，代表大多数的受体卵母细胞线粒体不能有效地与供体细胞的细胞核^1，10一起工作。iSCNT中使用的两个物种之间更大的分类学差距可能加剧了这一问题;产生属内活的后代（使用金牛座卵母细胞的博斯高鲁斯和博斯印度支原体后代）以及通过传统SCNT产生的后代（例如使用奥维斯白羊卵母细胞的奥维斯白羊座后代）被证明是嵌合体（来自两个个体的mtDNA存在于这些动物^11，12，13中）。然而，它们比代间SCNT胚胎^14，15发育得更远。卵母细胞线粒体和供体细胞核之间的信息交换在属内胚胎中可能比在代间胚胎中更成功¹⁶。

成熟牛卵母细胞中mtDNA的量大约是一个体细胞¹²中发现的量的100倍。降低该比例可以鼓励体细胞线粒体在重建的胚胎内增殖，从而允许存在更多的生产性线粒体群体¹⁶。这反过来又可以提供更多的能量来满足发育中的胚胎^15的要求。先前为减少卵母细胞或胚胎的mtDNA拷贝数所做的尝试包括化学应用、显微操作、以及用来自供体细胞种^16、17、18、^19、20的附加线粒体补充卵母细胞或胚胎。然而，化学应用（如2’，3′-二脱氧胞苷）对于胚胎发育并不理想，并且已将卵母细胞mtDNA拷贝数减少了约^18的一半。先前通过显微操作减少卵母细胞mtDNA仅平均去除了卵母细胞mtDNA¹⁷的64%。虽然补充供体细胞线粒体可能是一个可行的选择，但在iSCNT研究²¹中，其使用尚未产生活的代间动物。

使用二分法减少卵母细胞mtDNA拷贝数尚未在已发表的研究中使用。将卵母细胞一分为二，目的是将卵母细胞与体细胞融合在一起是手工克隆（HMC）的前提，它通常使用二分切作为从中期II（MII）卵母细胞中去除极体和中期板的方法。HMC已经成功地在几个物种中产生了后代，包括山羊，牛，猪，绵羊和马^{22，23，24，25，26}，但通常不包括在一对分离之前的离心步骤。整合卵母细胞的高速离心允许在卵母细胞的一极分离线粒体（因此mtDNA），然后可以使用微刀片将其一分为二以除去那些线粒体致密的组分。然后，两个线粒体耗尽的ooplast可以与体细胞融合，就像HMC中的情况一样，形成一个重建的胚胎，其含有来自卵母细胞物种的mtDNA相当少。

我们试图用这个方案来回答的问题是如何减少牛卵母细胞中的mtDNA，以产生含有较少异质mtDNA的活的重建胚胎。在该协议中，卵母细胞被离心并一分为二。计算卵母细胞和完整的卵母细胞mtDNA拷贝数，以确定该技术在减少牛卵母细胞的mtDNA拷贝数方面的有效性。