Sfengozin 1-Fosfat Reseptörlerinin Yapılarını ve Sinyal Yollarını Araştırmak İçin Bir Boru Hattı

Hücre zarındaki sfengolipidlerin metabolik bir ürünü olan Sfengosin-1-fosfat (S1P), lenfosit kaçakçılığı, vasküler gelişim, endotel bütünlüğü ve kalp atış hızı ^1,2,3 dahil olmak üzere çeşitli biyolojik aktiviteleri içeren her yerde bulunan bir lizofosfatidik sinyal molekülüdür. S1P, çeşitli fizyolojik etkilerini beş S1P reseptör alt tipi (S1PRs 1-5) aracılığıyla uygular; S1PR’ler çeşitli dokularda bulunur ve aşağı akış G proteinleri için benzersiz tercihler sergiler ^4,5. S1PR1 öncelikle daha sonra cAMP üretimini inhibe eden Gi proteini ile birleştirilir; S1PR2 ve S1PR3, Gi, Gq ve G12/13 ile birleştirilir ve S1PR4 ve S1PR5, Gi ve G12/13⁶ üzerinden sinyal dönüştürür.

S1P-S1PR sinyalizasyonu, otoimmün bozukluklar⁷, inflamasyon⁸, kanser 9 ve hatta COVID-19¹⁰ dahil olmak üzere birçok hastalık için kritik bir terapötik hedeftir. 2010 yılında, fingolimod (FTY720), nüks multipl sklerozu (MS) 11’i tedavi etmek için S1PR’leri hedefleyen birinci sınıf bir ilaç olarak lisanslanmıştır^. Bununla birlikte, S1PR2 hariç tüm S1PR’lere bağlanabilirken, S1PR3’e spesifik olmayan bağlanma, serebral korteksin ödemi, vasküler ve bronşiyal daralma ve akciğer epitel sızıntısı¹² ile sonuçlanır. Terapötik seçiciliği arttırmak için alternatif bir strateji olarak, reseptör için alt tipe özgü ligandlar üretilmiştir. Siponimod (BAF312) 2019 yılında nüks MS tedavisi için onaylanmıştır¹³; S1PR1 ve S1PR5’i etkili bir şekilde hedeflerken, S1PR3 için afinitesi yoktur, klinik uygulamada daha az yan etki gösterir¹⁴. 2020 yılında, ABD Gıda ve İlaç İdaresi, MS tedavisi için ozanimod’u yetkilendirdi¹⁵. Ozanimod’un S1PR1 için S1PR5^16’dan 25 kat daha fazla seçiciliğe sahip olduğu bildirilmiştir. Özellikle, mevcut COVID-19 pandemisi bağlamında, S1PR’leri hedef alan agonist ilaçların, immünomodülatör tedavi teknikleri kullanılarak COVID-19’u tedavi etmek için kullanılabileceği keşfedilmiştir¹⁷. Fingolimod ile karşılaştırıldığında, ozanimod COVID-19 hastalarında semptomları azaltmada üstünlük göstermiştir ve şimdi klinik çalışmalardan geçmektedir¹⁰. S1PR’lerin yapısal temelini ve işlevini anlamak, S1PR’ler^18’i seçici olarak hedefleyen bir ilaç geliştirmek için önemli bir temel oluşturur.

X-ışını kristalografisi, nükleer manyetik rezonans (NMR) ve elektron mikroskobu (EM) dahil olmak üzere biyomakromoleküllerin yapısal bilgilerini araştırmak için birçok teknik kullanılmaktadır. Mart 2022 itibariyle, Protein Veri Bankası’na (PDB) yatırılan 180.000’den fazla yapı var ve bunların çoğu X-ışını kristalografisi ile çözüldü. Bununla birlikte, Yifan Cheng ve David Julius tarafından 2013^19’da bildirilen TPRV1’in ilk atomik çözünürlüğe yakın yapısı (3.4 şçözünürlük) ile, kriyo-elektron mikroskobu (kriyo-EM) protein yapıları için ana akım bir teknik haline gelmiştir ve EM PDB yapılarının toplam sayısı 10.000’den fazlaydı. Kritik atılım alanları, doğrudan elektron algılama kameraları ve yeni görüntü işleme algoritmaları olarak bilinen görüntüleme için yeni kameraların geliştirilmesidir. Cryo-EM, son on yılda yapı biyolojisinde ve yapı tabanlı ilaç keşfinde devrim yarattı²⁰. Makromoleküler komplekslerin canlı hücredeki karmaşık rollerini nasıl yerine getirdiklerini anlamak, biyolojik bilimlerde merkezi bir tema olduğundan, kriyo-EM, özellikle transmembran proteinleri için dinamik moleküler komplekslerin konformasyonlarını ortaya çıkarma potansiyeline sahiptir²¹. G-protein eşleşmiş reseptörleri (GPCR’ler), transmembran proteinlerinin en büyük süper ailesidir ve şu anda pazarlanan ilaçların% 30’undan fazlasının hedefleridir²². Kriyo-EM’nin gelişimi, GPCR-G protein komplekslerinin yüksek çözünürlüklü yapılarının patlamasına katkıda bulunarak, ilaç tasarımında X-ışını kristalografik analizi için hala erişilemeyen ‘inatçı’ hedefler için yapısal belirlemeyi mümkün kılmıştır²³. Bu nedenle, kriyo-EM uygulaması, GPCR’lerin üç boyutlu yapısını, atomik çözünürlük^24’e yakın doğal koşullarda belirleme şansı sağlar. Kriyo-EM’deki ilerlemeler, GPCR stimülasyonunun veya inhibisyonunun mekanik temellerini görselleştirmeyi mümkün kılmakta ve GPCR hedefli ilaç üretimi için yeni bağlanma bölgelerinin ortaya çıkarılmasında daha fazla fayda sağlamaktadır²⁵.

Kriyo-EM teknolojisinin muazzam adımlarına dayanarak, son zamanlarda^26,27 olan acı çeken S1PR1-^, S1PR3- ve S1PR5-Gi sinyal komplekslerinin yapılarını belirledik. İnsanlarda, S1PR’ler çeşitli dokularda bulunur ve aşağı akış G proteinleri ^4,5 için benzersiz tercihler sergiler. S1PR1 öncelikle Gi proteini ile birleştirilir ve bu da daha sonra 3′,5′-siklik adenozin monofosfat (cAMP) üretimini inhibe eder. S1PR3 ve S1PR5 ayrıca Gi ^6,28 ile birleşebilir. Gi-kuplajlı reseptör aktivasyonu cAMP^29’un üretimini azalttığından, fonksiyonel değişiklikleri yakalamak için cAMP inhibisyon etkilerini ölçmek için bir Gi-inhibisyon cAMP testi tanıtıldı^26,27. Bir cAMP bağlayıcı protein parçasının yerleştirildiği Photinus pyralis luciferase’in mutant bir versiyonunu kullanarak, bu cAMP testi, hücre içi cAMP konsantrasyonundaki değişiklikler yoluyla GPCR aktivitesini izlemek için basit ve güvenilir bir yöntem sunar³⁰. Hassas ve radyoaktif olmayan fonksiyonel bir testtir ve ilaç keşfi amacıyla çok çeşitli GPCR’lerin gerçek zamanlı aşağı akış sinyalizasyonunu izlemek için uygulanabilir³¹.

Burada, öncelikle kriyo-EM manipülasyonları ve bir Gi-inhibisyon cAMP testi dahil olmak üzere, S1PR’lerin aktivasyon ve ilaç tanıma modlarının çözümünde kritik yöntemlerin bir özeti verilmiştir. Bu makale, GPCR’lerin yapı ve işlevlerine yönelik daha ileri araştırmalar için kapsamlı deneysel rehberlik sağlamayı amaçlamaktadır.