Una tubería para investigar las estructuras y vías de señalización de los receptores de esfingosina 1-fosfato

La esfingosina-1-fosfato (S1P), un producto metabólico de los esfingolípidos en la membrana celular, es una molécula de señalización lisofosfatídica ubicua que involucra diversas actividades biológicas, incluyendo el tráfico de linfocitos, el desarrollo vascular, la integridad endotelial y la frecuencia cardíaca ^1,2,3. S1P ejerce sus diversos efectos fisiológicos a través de cinco subtipos de receptores S1P (S1PRs 1-5); Los S1PR se encuentran en una variedad de tejidos y exhiben preferencias únicas por las proteínas G aguas abajo ^4,5. S1PR1 se combina principalmente con la proteína Gi, que posteriormente inhibe la producción de cAMP; S1PR2 y S1PR3 están acoplados con Gi, Gq y G12/13, y S1PR4 y S1PR5 transducen la señal a través de Gi y G12/13⁶.

La señalización S1P-S1PR es un objetivo terapéutico crítico para múltiples enfermedades, incluidos los trastornos autoinmunes⁷, la inflamación⁸, el cáncer⁹ e incluso COVID-19¹⁰. En 2010, el fingolimod (FTY720) fue autorizado como un fármaco de primera clase dirigido a S1PR para tratar la esclerosis múltiple (EM) de ^recaída11. Sin embargo, es capaz de unirse a todos los S1PR excepto a S1PR2, mientras que la unión no específica a S1PR3 produce edema de la corteza cerebral, constricción vascular y bronquial, y fuga epitelial pulmonar¹². Como estrategia alternativa para aumentar la selectividad terapéutica, se han producido ligandos específicos de subtipo para el receptor. Siponimod (BAF312) fue aprobado en 2019 para el tratamiento de la EM en recaída¹³; se dirige eficazmente a S1PR1 y S1PR5, mientras que no tiene afinidad por S1PR3, exhibiendo menos efectos secundarios en la práctica clínica¹⁴. En 2020, la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos autorizó ozanimod para la terapia de EM¹⁵. Se ha informado que ozanimod tiene una selectividad 25 veces mayor para S1PR1 que para S1PR5¹⁶. En particular, en el contexto de la actual pandemia de COVID-19, se ha descubierto que los fármacos agonistas dirigidos a S1PR pueden utilizarse para tratar COVID-19 mediante el uso de técnicas de terapia inmunomoduladora¹⁷. En comparación con el fingolimod, el ozanimod ha demostrado superioridad en la reducción de los síntomas en pacientes con COVID-19 y ahora está siendo sometido a ensayos clínicos¹⁰. Comprender la base estructural y la función de los S1PR establece una base significativa para desarrollar un fármaco que se dirija selectivamente a los S1PR¹⁸.

Se utilizan muchas técnicas para investigar la información estructural de las biomacromoléculas, incluida la cristalografía de rayos X, la resonancia magnética nuclear (RMN) y la microscopía electrónica (EM). A marzo de 2022, hay más de 180.000 estructuras depositadas en el Protein Databank (PDB), y la mayoría de ellas se han resuelto mediante cristalografía de rayos X. Sin embargo, con la primera estructura de resolución casi atómica de TPRV1 (resolución 3.4 Å) reportada por Yifan Cheng y David Julius en 2013¹⁹, la microscopía crioelectrónica (crio-EM) se ha convertido en una técnica convencional para estructuras de proteínas, y el número total de estructuras EM PDB fue de más de 10,000. Las áreas críticas de avance son el desarrollo de nuevas cámaras para imágenes conocidas como cámaras de detección directa de electrones y nuevos algoritmos de procesamiento de imágenes. Cryo-EM ha revolucionado la biología de la estructura y el descubrimiento de fármacos basados en la estructura en la última década²⁰. Como la comprensión de cómo los complejos macromoleculares cumplen sus complicadas funciones en la célula viva es un tema central en las ciencias biológicas, la crio-EM tiene el potencial de revelar conformaciones de complejos moleculares dinámicos, particularmente para proteínas transmembrana²¹. Los receptores acoplados a proteínas G (GPCR) son la superfamilia más grande de proteínas transmembrana y los objetivos de más del 30% de los productos farmacéuticos comercializados actualmente²². El desarrollo de crio-EM ha contribuido a una explosión de estructuras de alta resolución de complejos de proteínas GPCR-G, permitiendo la determinación estructural de objetivos “intratables” que aún no son accesibles para el análisis cristalográfico de rayos X en el diseño de fármacos²³. Por lo tanto, la aplicación crio-EM proporciona la oportunidad de determinar la estructura tridimensional de los GPCR en condiciones casi nativas cercanas a la resolución atómica²⁴. Los avances en crio-EM permiten visualizar los fundamentos mecanicistas de la estimulación o inhibición de GPCR, y un beneficio adicional en el descubrimiento de los nuevos sitios de unión para la creación de fármacos dirigidos a GPCR²⁵.

Confiando en los tremendos avances de la tecnología crio-EM, hemos identificado estructuras de complejos de señalización S1PR1-, S1PR3- y S1PR5-Gi agonizantes recientemente^26,27. En humanos, los S1PR se encuentran en varios tejidos y exhiben preferencias únicas por las proteínas G aguas abajo ^4,5. S1PR1 se combina principalmente con la proteína Gi, que posteriormente inhibe la producción de monofosfato de adenosina cíclico (cAMP) 3′,5′. S1PR3 y S1PR5 también son capaces de acoplarse con Gi ^6,28. Dado que la activación del receptor acoplado a Gi disminuye la producción de cAMP²⁹, se introdujo un ensayo de inhibición de Gi-amp para medir los efectos de inhibición de cAMP para capturar alteraciones funcionales^26,27. Utilizando una versión mutante de Photinus pyralis luciferase en la que se ha insertado una fracción de proteína de unión a cAMP, este ensayo de cAMP ofrece un método simple y confiable para monitorear la actividad de GPCR a través de cambios en la concentración intracelular de cAMP³⁰. Es un ensayo funcional sensible y no radiactivo y puede aplicarse para monitorear la señalización descendente en tiempo real de una amplia gama de GPCR con fines de descubrimiento de fármacos³¹.

Aquí, se proporciona un resumen de los métodos críticos para resolver los modos de activación y reconocimiento de fármacos de S1PR, que incluyen principalmente manipulaciones crio-EM y un ensayo de cAMP de inhibición Gi. Este artículo tiene como objetivo proporcionar una guía experimental completa para futuras exploraciones en las estructuras y funciones de los GPCR.