Um pipeline para investigar as estruturas e caminhos de sinalização de receptores sphingosine 1-fosfato

Sphingosine-1-fosfato (S1P), um produto metabólico de sphingolipids na membrana celular, é uma molécula de sinalização linfosfídica onipresente que envolve várias atividades biológicas, incluindo tráfico de linfócitos, desenvolvimento vascular, integridade endotelial e frequência cardíaca ^1,2,3. O S1P exerce seus diversos efeitos fisiológicos através de cinco subtipos receptores S1P (S1PRs 1-5); Os S1PRs são encontrados em uma variedade de tecidos e exibem preferências únicas para proteínas G a jusante ^4,5. O S1PR1 é principalmente acoplado à proteína Gi, que posteriormente inibe a produção de cAMP; S1PR2 e S1PR3 são acoplados com Gi, Gq e G12/13, e S1PR4 e S1PR5 transdutos através de Gi e G12/13⁶.

A sinalização S1P-S1PR é um alvo terapêutico crítico para múltiplas doenças, incluindo doenças autoimunes⁷, inflamação⁸, câncer⁹ e até COVID-19¹⁰. Em 2010, o fingolimod (FTY720) foi licenciado como um medicamento de primeira classe direcionado aos S1PRs para tratar a esclerose múltipla da recaída (MS)¹¹. No entanto, é capaz de vincular a todos os S1PRs, exceto S1PR2, enquanto a ligação inespecífica ao S1PR3 resulta em edema do córtex cerebral, constrição vascular e brônquica e vazamento epitelial^{pulmonar 12}. Como estratégia alternativa para aumentar a seletividade terapêutica, foram produzidos ligantes específicos do subtipo para o receptor. O Siponimod (BAF312) foi aprovado em 2019 para o tratamento de recaída de MS¹³; ele visa efetivamente S1PR1 e S1PR5, enquanto não tem afinidade com OPR3, apresentando menos efeitos colaterais na prática clínica¹⁴. Em 2020, a Food and Drug Administration dos EUA autorizou o ozanimod para a terapia de^{ESM 15}. Foi relatado que o ozanimod possui uma seletividade 25 vezes maior para S1PR1 do que para S1PR5¹⁶. Notavelmente, no contexto da atual pandemia COVID-19, descobriu-se que drogas agonistas direcionadas às S1PRs podem ser utilizadas para tratar o COVID-19 usando técnicas de terapia imunomodulatória¹⁷. Em comparação com fingolimod, o ozanimod tem mostrado superioridade na redução dos sintomas em pacientes COVID-19 e agora está sendo submetido a testes clínicos¹⁰. Compreender a base estrutural e a função dos S1PRs estabelece uma base significativa para o desenvolvimento de uma droga que tem como alvo seletivamente as S1PRs¹⁸.

Muitas técnicas são usadas para investigar as informações estruturais de biomacromléculas, incluindo cristalografia de raios-X, ressonância magnética nuclear (RMN) e microscopia eletrônica (EM). A partir de março de 2022, existem mais de 180.000 estruturas depositadas no Protein Databank (PDB), e a maioria delas foi resolvida pela cristalografia de raios-X. No entanto, com a primeira estrutura de resolução quase atômica da TPRV1 (resolução 3.4 Å) relatada por Yifan Cheng e David Julius em 2013¹⁹, a microscopia crio-elétron (crio-EM) tornou-se uma técnica mainstream para estruturas proteicas, e o número total de estruturas em PDB foi superior a 10.000. As áreas de avanço crítica são o desenvolvimento de novas câmeras para imagens conhecidas como câmeras diretas de detecção de elétrons e novos algoritmos de processamento de imagens. A Crio-EM revolucionou a biologia da estrutura e a descoberta de drogas baseada em estruturas na última década²⁰. Como entender como os complexos macromoleculares cumprem seus complicados papéis na célula viva é um tema central nas ciências biológicas, o crio-EM tem o potencial de revelar conformações de complexos moleculares dinâmicos, particularmente para proteínas transmembranas²¹. Os receptores acoplados à proteína G (GPCRs) são a maior superfamília de proteínas transmembranas e as metas de mais de 30% dos fármacos atualmente comercializados²². O desenvolvimento da crio-EM contribuiu para uma explosão de estruturas de alta resolução de complexos proteicos GPCR-G, permitindo a determinação estrutural para alvos “intratáveis” que ainda não estão acessíveis à análise cristalográfica de raios-X no design^{de medicamentos 23}. Assim, o aplicativo crio-EM oferece a chance de determinar a estrutura tridimensional dos GPCRs em condições quase nativas perto da resolução atômica²⁴. Os avanços no crio-EM tornam possível visualizar fundamentos mecanicistas da estimulação ou inibição do GPCR, e se beneficiar ainda mais na descoberta dos novos locais de vinculação para a criação de medicamentos direcionados ao GPCR²⁵.

Contando com os tremendos avanços da tecnologia crio-EM, identificamos estruturas de complexos de sinalização Agonizantes S1PR1-, S1PR3 e S1PR5-Gi recentemente^26,27. Em humanos, os S1PRs são encontrados em vários tecidos e exibem preferências únicas para proteínas G a jusante ^4,5. O S1PR1 é principalmente associado à proteína Gi, que posteriormente inibe a produção de monofosfato de adenosina 3′,5′cíclica (cAMP). S1PR3 e S1PR5 também são capazes de acoplamento com Gi ^6,28. Uma vez que a ativação do receptor acoplado gi diminui a produção de cAMP²⁹, um ensaio de cAMP de inibição gi foi introduzido para medir os efeitos de inibição de cAMP para capturar alterações funcionais ^26,27. Usando uma versão mutante de Photinus pyralis luciferase em que uma umidade de proteína de ligação cAMP foi inserida, este ensaio cAMP oferece um método simples e confiável para monitorar a atividade gpcr através de alterações na concentração cAMP intracelular³⁰. É um ensaio funcional sensível e não radioativo e pode ser aplicado para monitorar a sinalização a jusante em tempo real de uma ampla gama de GPCRs para fins de descoberta de drogas³¹.

Aqui, é fornecido um resumo dos métodos críticos na resolução dos modos de ativação e reconhecimento de drogas dos S1PRs, incluindo principalmente manipulações crio-EM e um ensaio cAMP de inibição gi. Este artigo tem como objetivo fornecer orientação experimental abrangente para novas explorações nas estruturas e funções dos GPCRs.