스핑고신 1-인산염 수용체의 구조와 신호전달 경로를 조사하는 파이프라인

세포막에서 스핑고지질의 대사 산물인 스핑고신-1-포스페이트(S1P)는 림프구 밀매, 혈관 발달, 내피 완전성, 심박수^1,2,3을 포함한 다양한 생물학적 활동을 수반하는 유비쿼터스 리소포스파티드 신호전달 분자이다. S1P는 5개의 S1P 수용체 아류형(S1PRs 1-5)을 통해 다양한 생리적 효과를 발휘한다. S1PR은 다양한 조직에서 발견되며 하류 G 단백질 ^4,5에 대한 독특한 선호도를 나타냅니다. S1PR1은 주로 Gi 단백질과 결합하며, 이는 후속적으로 cAMP 생산을 억제합니다. S1PR2 및 S1PR3은 Gi, Gq 및 G12/13과 결합되고, S1PR4 및 S1PR5는 Gi 및 G12/13⁶을 통해 신호를 트랜스듀스한다.

S1P-S1PR 신호전달은 자가면역 장애⁷, 염증8, 암 9, 심지어 COVID-19 ¹⁰을 포함한 다수의 질환에 대한 중요한 치료 표적이다. 2010년, 핀골리모드(FTY720)는 재발성 다발성 경화증(^MS)11을 치료하기 위해 S1PR을 표적으로 하는 동급 최초의 약물로 허가되었습니다. 그러나, S1PR2를 제외한 모든 S1PR에 결합할 수 있는 반면, S1PR3에 대한 비특이적 결합은 대뇌 피질의 부종, 혈관 및 기관지 수축, 폐 상피 누출⁽¹²)을 초래한다. 치료 선택성을 증가시키기 위한 대안적인 전략으로서, 수용체에 대한 아류형 특이적 리간드가 생성되었다. 시포니모드 (BAF312)는 재발 MS 치료^{13에 대해 2019} 년에 승인되었다; S1PR1 및 S1PR5를 효과적으로 타겟팅하는 반면, S1PR3에 대한 친화력은 없으므로 임상 실습¹⁴에서 부작용이 적습니다. 2020 년 미국 식품의 약국 (Food and Drug Administration)은 MS 요법¹⁵에 대한 ozanimod를 승인했습니다. ozanimod는 S1PR5¹⁶보다 S1PR1에 대해 25 배 더 큰 선택성을 보유하고있다고보고되었습니다. 특히, 현재의 COVID-19 전염병의 맥락에서, S1PR을 표적으로 하는 작용제 약물이 면역조절 요법 기술⁽¹⁷)을 사용하여 COVID-19를 치료하는데 이용될 수 있다는 것이 발견되었다. 핀골리모드와 비교했을 때, 오자니모드는 COVID-19 환자의 증상을 낮추는 데 우월성을 보였으며, 현재 임상시험¹⁰을 진행 중이다. S1PR의 구조적 기초와 기능을 이해하는 것은 S1PRs⁽¹⁸)를 선택적으로 표적으로 하는 약물을 개발하기 위한 중요한 토대를 마련한다.

X선 결정학, 핵 자기 공명(NMR) 및 전자 현미경(EM)을 포함한 생체 거대분자의 구조 정보를 조사하기 위해 많은 기술이 사용됩니다. 2022년 3월 현재, 단백질 데이터뱅크(PDB)에 180,000개 이상의 구조물이 기탁되어 있으며, 대부분은 X선 결정학에 의해 해결되었다. 그러나 2013 년 Yifan Cheng과 David Julius가 2013¹⁹ 년에보고 한 TPRV1 (3.4 Å 해상도)의 첫 번째 근원자 분해능 구조로 인해 냉동 전자 현미경 (cryo-EM)은 단백질 구조의 주류 기술이되었으며 EM PDB 구조의 총 수는 10,000 개가 넘었습니다. 중요한 획기적인 분야는 직접 전자 감지 카메라 및 새로운 이미지 처리 알고리즘으로 알려진 이미징을위한 새로운 카메라 개발입니다. Cryo-EM은 지난²⁰ 년 동안 구조 생물학 및 구조 기반 약물 발견에 혁명을 일으켰습니다. 거대 분자 복합체가 살아있는 세포에서 복잡한 역할을 수행하는 방법을 이해하는 것이 생물 과학의 중심 주제이기 때문에 cryo-EM은 특히 막횡단 단백질²¹에 대한 동적 분자 복합체의 형태를 밝힐 수있는 잠재력을 가지고 있습니다. G-단백질 결합 수용체 (GPCRs)는 막횡단 단백질의 가장 큰 수퍼 패밀리이며 현재 시판되는 의약품²²의 30 % 이상을 대상으로합니다. cryo-EM의 개발은 GPCR-G 단백질 복합체의 고해상도 구조의 파열에 기여하여 약물 설계²³에서 X 선 결정 학적 분석에 여전히 접근 할 수없는 ‘난치성’표적에 대한 구조적 결정을 가능하게했습니다. 따라서, cryo-EM 애플리케이션은 원자 분해능(²⁴)에 가까운 거의 네이티브 조건에서 GPCR의 입체 구조를 결정할 기회를 제공한다. cryo-EM의 발전은 GPCR 자극 또는 억제의 기계론적 토대를 시각화하는 것을 가능하게 하고, GPCR 표적 약물 생성⁽²⁵)을 위한 신규한 결합 부위를 밝히는데 더 많은 이익을 가져온다.

cryo-EM 기술의 엄청난 진보에 의지하여, 우리는 최근^26,27 개의 고뇌하는 S1PR1-^, S1PR3- 및 S1PR5-Gi 신호 복합체의 구조를 확인했습니다. 인간에서, S1PR은 다양한 조직에서 발견되며 하류 G 단백질 ^4,5에 대한 독특한 선호도를 나타낸다. S1PR1은 주로 Gi 단백질과 결합하며, 이후 3′,5′-cyclic adenosine monophosphate (cAMP) 생산을 억제합니다. S1PR3 및 S1PR5는 Gi ^6,28과도 결합할 수 있습니다. Gi 결합 수용체 활성화가 cAMP 29의 생산을 감소시키기 때문에, 기능적 변화를 포착하기 위한 cAMP 억제 효과를 측정하기 위해 Gi-억제 cAMP 분석법이 도입되었다^26,27. cAMP 결합 단백질 모이어티가 삽입된 포티누스 피랄리스 루시퍼라제의 돌연변이 버전을 사용하여, 이 cAMP 분석은 세포내 cAMP 농도³⁰의 변화를 통해 GPCR 활성을 모니터링하기 위한 간단하고 신뢰할 수 있는 방법을 제공한다. 이는 민감하고 비방사성 기능성 분석법이며, 약물 발견 목적을 위해 광범위한 GPCRs의 실시간 다운스트림 신호전달을 모니터링하는데 적용될 수 있다⁽³¹).

여기서, S1PRs의 활성화 및 약물 인식 모드를 해결하는데 있어서 중요한 방법들에 대한 요약이 제공되며, 주로 cryo-EM 조작 및 Gi-억제 cAMP 분석을 포함한다. 이 기사는 GPCR의 구조와 기능에 대한 추가 탐구를위한 포괄적 인 실험 지침을 제공하는 것을 목표로합니다.