スフィンゴシン1-リン酸受容体の構造とシグナル伝達経路を調べるパイプライン

細胞膜におけるスフィンゴ脂質の代謝産物であるスフィンゴシン-1-リン酸(S1P)は、リンパ球輸送、血管発達、内皮完全性、および心拍数^1,2,3を含む様々な生物学的活性を含むユビキタスなリゾホスファチド性シグナル伝達分子である。S1Pは、5つのS1P受容体サブタイプ(S1PRs1〜5)を介して多様な生理学的効果を発揮する。S1PRは様々な組織に見られ、下流のGタンパク質に対して独特の嗜好を示す^4,5。S1PR1は主にGiタンパク質と結合し、その後cAMP産生を阻害する。S1PR2 および S1PR3 は Gi、Gq、および G12/13 と結合され、S1PR4 および S1PR5 は Gi および G12/13 を介して信号を伝送^します。

S1P-S1PRシグナル伝達は、自己免疫疾患⁷、炎症⁸、癌9、さらにはCOVID-19¹⁰を含む複数の疾患の重要な治療標的である。2010年、フィンゴリモド(FTY720)は、再発性多発性硬化症(MS)を治療するためのS1PRを標的とするクラス初の薬物として認可されました¹¹。しかしながら、S1PR2を除く全てのS1PRsに結合することができるが、S1PR3への非特異的結合は、大脳皮質の浮腫、血管および気管支狭窄、ならびに肺上皮漏出をもたらす¹²。治療選択性を高めるための代替戦略として、受容体に対するサブタイプ特異的リガンドが産生されている。シポニモド(BAF312)は、再発MS治療のために2019年に承認されました¹³;S1PR1およびS1PR5を効果的に標的とするが、S1PR3に対する親和性はなく、臨床現場でより少ない副作用を示す¹⁴。2020年、米国食品医薬品局(FDA)はオザニモドをMS治療に承認しました¹⁵。オザニモドは、S1PR5¹⁶よりもS1PR1に対して25倍大きい選択性を保持することが報告されている。特に、現在のCOVID-19パンデミックの文脈では、S1PRを標的とするアゴニスト薬が、免疫調節療法技術を使用してCOVID-19を治療するために利用され得ることが発見されている¹⁷。フィンゴリモドと比較して、オザニモドはCOVID-19患者の症状を軽減する上で優位性を示しており、現在臨床試験^{を受けています10}。S1PRの構造的基礎と機能を理解することは、S1PRsを選択的に標的とする薬剤を開発するための重要な基盤を築く¹⁸。

生体高分子の構造情報を調べるには、X線結晶構造解析、核磁気共鳴(NMR)、電子顕微鏡(EM)など、多くの技術が用いられています。2022年3月現在、タンパク質データバンク(PDB)には18万以上の構造が堆積しており、そのほとんどはX線結晶構造解析によって解明されています。しかし、2013年にYifan ChengとDavid Juliusによって報告されたTPRV1の最初の原子分解能に近い分解能構造(3.4 Å分解能)¹⁹では、クライオ電子顕微鏡(cryo-EM)がタンパク質構造の主流技術となり、EM PDB構造の総数は10,000を超えました。重要なブレークスルー分野は、直接電子検出カメラとして知られるイメージング用の新しいカメラと新しい画像処理アルゴリズムの開発です。Cryo-EMは、過去10年間で構造生物学と構造ベースの創薬に革命をもたらしました²⁰。高分子複合体が生細胞内で複雑な役割を果たす方法を理解することは、生物科学の中心的なテーマであるため、クライオEMは、特に膜貫通タンパク質²¹について、動的分子複合体の立体構造を明らかにする可能性を秘めています。Gタンパク質共役型受容体(GPCR)は、膜貫通タンパク質の最大のスーパーファミリーであり、現在市販されている医薬品の30%以上の標的である²²。クライオEMの開発は、GPCR-Gタンパク質複合体の高分解能構造のバーストに貢献し、薬物設計におけるX線結晶学的解析にはまだアクセスできない「難治性」標的の構造決定を可能にした²³。したがって、クライオEMアプリケーションは、原子分解能²⁴に近いネイティブに近い条件下でGPCRの3次元構造を決定する機会を提供します。クライオEMの進歩により、GPCRの刺激または阻害の機構的基盤を視覚化することが可能になり、GPCR標的薬作成のための新規結合部位の解明にさらなる利益をもたらす²⁵。

クライオEM技術の驚異的な進歩に依拠して、我々は最近、苦悶のS1PR1-、S1PR3-、およびS1PR5-Giシグナル伝達複合体の構造を特定した^26,27。ヒトでは、S1PRは様々な組織に見出され、下流のGタンパク質に対して独特の嗜好を示す^4,5。S1PR1は主にGiタンパク質と結合し、その後、3′,5′-環状アデノシン一リン酸(cAMP)産生を阻害する。S1PR3およびS1PR5は、Gi ^6,28との結合も可能である。Gi共役型受容体活性化はcAMP29の産生を減少させるので、機能的変化を捕捉するためのcAMP阻害効果を測定するためにGi阻害cAMPアッセイが導入された^26、27。cAMP結合タンパク質部分が挿入されたPhotinus pyralis lucifereraseの変異バージョンを使用して、このcAMPアッセイは、細胞内cAMP濃度の変化を介してGPCR活性をモニタリングするための簡単で信頼性の高い方法を提供する³⁰。これは、高感度で非放射性の機能アッセイであり、創薬目的で広範囲のGPCRのリアルタイムの下流シグナル伝達をモニターするために適用することができる³¹。

ここでは、S1PRの活性化モードと薬物認識モードを解決する上で重要な方法の概要が提供され、主にクライオ-EM操作とGi阻害cAMPアッセイが含まれます。本稿は、GPCRの構造と機能をさらに探求するための包括的な実験的ガイダンスを提供することを目的としている。