צינור לחקר המבנים ומסלולי האיתות של קולטני ספינגוזין 1-פוספט

ספינגוזין-1-פוספט (S1P), תוצר מטבולי של ספינגוליפידים בקרום התא, היא מולקולת איתות ליזופוספטידית הנמצאת בכל מקום ומערבת פעילויות ביולוגיות שונות, כולל סחר בלימפוציטים, התפתחות כלי דם, שלמות האנדותל וקצב לב ^1,2,3. S1P מפעיל את ההשפעות הפיזיולוגיות המגוונות שלו באמצעות חמישה תת-סוגים של קולטני S1P (S1PRs 1-5); S1PRs נמצאים במגוון רקמות ומפגינים העדפות ייחודיות לחלבוני G^במורד הזרם ^4,5. S1PR1 מוצמד בעיקר לחלבון Gi, אשר לאחר מכן מעכב את ייצור cAMP; S1PR2 ו-S1PR3 משולבים עם Gi, Gq ו-G12/13, ואות מתמר S1PR4 ו-S1PR5 דרך Gi ו-G12/13⁶.

איתות S1P-S1PR הוא יעד טיפולי קריטי למחלות מרובות, כולל הפרעות אוטואימוניות⁷, דלקת⁸, סרטן⁹ ואפילו COVID-19¹⁰. בשנת 2010, פינגולימוד (FTY720) קיבל רישיון כתרופה ראשונה מסוגה המכוונת נגד S1PRs לטיפול בטרשת נפוצה חוזרת (MS)¹¹. עם זאת, הוא מסוגל להיקשר לכל S1PRs למעט S1PR2, בעוד שקשירה לא ספציפית ל- S1PR3 גורמת לבצקת של קליפת המוח, כיווץ כלי הדם והסימפונות ודליפת אפיתל הריאה¹². כאסטרטגיה חלופית להגברת הסלקטיביות הטיפולית, נוצרו ליגנדות ספציפיות לתת-סוג עבור הקולטן. סיפונימוד (BAF312) אושרה בשנת 2019 לטיפול בטרשת נפוצה^{חוזרת 13}; הוא מכוון ביעילות ל-S1PR1 ול-S1PR5, בעוד שאין לו זיקה ל-S1PR3, מה שמפגין פחות תופעות לוואי בקליניקה¹⁴. בשנת 2020, מנהל המזון והתרופות האמריקאי אישר אוזנימוד לטיפול בטרשת נפוצה¹⁵. דווח כי אוזנימוד מחזיק בסלקטיביות גדולה פי 25 עבור S1PR1 מאשר עבור S1PR5¹⁶. יש לציין כי בהקשר של מגפת COVID-19 הנוכחית, התגלה כי תרופות אגוניסטיות המכוונות ל- S1PRs עשויות לשמש לטיפול ב- COVID-19 על ידי שימוש בטכניקות טיפול אימונומודולטוריות¹⁷. בהשוואה לפינגולימוד, האוזנימוד הראה עליונות בהורדת הסימפטומים בחולי COVID-19 וכעת הוא עובר ניסויים קליניים¹⁰. הבנת הבסיס המבני והתפקוד של S1PRs מניחה בסיס משמעותי לפיתוח תרופה המכוונת באופן סלקטיבי ל- S1PRs¹⁸.

טכניקות רבות משמשות לחקר המידע המבני של ביו-מקרומולקולות, כולל קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן, תהודה מגנטית גרעינית (NMR) ומיקרוסקופיית אלקטרונים (EM). נכון למרץ 2022, ישנם יותר מ -180,000 מבנים שהופקדו בבנק נתוני החלבון (PDB), ורובם נפתרו על ידי קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן. עם זאת, עם מבנה הרזולוציה הכמעט אטומית הראשונה של TPRV1 (רזולוציה 3.4 Å) שדווחה על ידי ייפאן צ’נג ודיוויד יוליוס בשנת 2013¹⁹, מיקרוסקופיית קריו-אלקטרונים (cryo-EM) הפכה לטכניקה מרכזית עבור מבני חלבונים, והמספר הכולל של מבני EM PDB היה יותר מ -10,000. התחומים פורצי הדרך הקריטיים הם פיתוח מצלמות חדשות להדמיה המכונות מצלמות לגילוי אלקטרונים ישירים ואלגוריתמים חדשים לעיבוד תמונה. Cryo-EM חוללה מהפכה בביולוגיה של מבנים ובגילוי תרופות מבוססות מבנה בעשור^ה-20 האחרון. מכיוון שהבנת האופן שבו קומפלקסים מקרומולקולריים ממלאים את תפקידיהם המורכבים בתא החי היא נושא מרכזי במדעי הביולוגיה, לקריו-EM יש פוטנציאל לחשוף קונפורמציות של קומפלקסים מולקולריים דינמיים, במיוחד עבור חלבונים טרנס-ממברניים²¹. קולטנים מצומדים לחלבון G (GPCRs) הם משפחת-העל הגדולה ביותר של חלבוני טרנס-ממברנה והמטרות של יותר מ-30% מהתרופות המשווקות כיום²². הפיתוח של cryo-EM תרם לפרץ של מבנים ברזולוציה גבוהה של קומפלקסים של חלבוני GPCR-G, המאפשרים קביעה מבנית של מטרות ‘בלתי פתירות’ שעדיין אינן נגישות לניתוח קריסטלוגרפי של קרני רנטגן בתכנון תרופות²³. לפיכך, יישום cryo-EM מספק הזדמנות לקבוע את המבנה התלת-ממדי של GPCRs בתנאים כמעט מקומיים ברזולוציה אטומית קרובה לרזולוציה אטומית²⁴. ההתקדמות ב- cryo-EM מאפשרת לדמיין יסודות מכניסטיים של גירוי או עיכוב GPCR, ותועלת נוספת בחשיפת אתרי הקשירה החדשים ליצירת תרופות ממוקדות GPCR²⁵.

בהסתמך על הצעדים האדירים של טכנולוגיית cryo-EM, זיהינו מבנים של מתחמי איתות S1PR1-, S1PR3 ו-S1PR5-Gi מיוסרים לאחרונה^26,27. בבני אדם, S1PRs נמצאים ברקמות שונות ומפגינים העדפות ייחודיות לחלבוני G^במורד הזרם ^4,5. S1PR1 מוצמד בעיקר לחלבון Gi, אשר לאחר מכן מעכב ייצור של 3′,5′-מחזורי של אדנוזין מונופוספט (cAMP). S1PR3 ו-S1PR5 מסוגלים גם לצימוד עם Gi ^6,28. מכיוון שהפעלת קולטן מצומד Gi מפחיתה את הייצור של cAMP²⁹, הוכנסה בדיקת cAMP לעיכוב Gi כדי למדוד את השפעות העיכוב של cAMP ללכידת שינויים פונקציונליים^26,27. באמצעות גרסה מוטנטית של Photinus pyralis luciferase שבה הוכנס חלבון קושר cAMP, בדיקת cAMP זו מציעה שיטה פשוטה ואמינה לניטור פעילות GPCR באמצעות שינויים בריכוז cAMP^{תוך תאי 30}. זוהי בדיקה תפקודית רגישה ולא רדיואקטיבית וניתן ליישם אותה כדי לנטר את האיתות בזמן אמת במורד הזרם של מגוון רחב של GPCRs למטרות גילוי תרופות³¹.

כאן, מסופק סיכום של השיטות הקריטיות לפתרון מצבי ההפעלה וזיהוי התרופות של S1PRs, כולל בעיקר מניפולציות cryo-EM ובדיקת cAMP של עיכוב Gi. מאמר זה נועד לספק הדרכה ניסיונית מקיפה לחקירות נוספות של המבנים והתפקודים של GPCRs.