CAM-Delam测定通过量化癌细胞的分层和侵袭能力来评分转移特性

简而言之， 图1 总结了CAM-Delam测定的总体步骤。以下方案基于30个培养的受精鸡蛋和使用两种不同的癌细胞系分别接种在三个环/鸡蛋中并在四个时间点进行分析。 1. 种蛋孵化 使用来自当地孵化场的受精雏鸡卵，保证超过90%的受精率注意：卵子在室温（RT）下储存的时间不应超过4天。在瑞典，实验性使用胚胎鸡的道德许可仅从胚胎第14天（E）开始及以后。 如果需要，使用干纸巾或湿水小心地机械擦去鸡蛋上的任何污垢或羽毛。 使用前（每次）用70%乙醇清洁并消毒鸡蛋孵化器。 将所需数量的蛋放入蛋盘中，并在湿度为70%的37.5-38°C的蛋孵化器中水平孵化雏鸡蛋。将其视为孵育日0（图1A）。 2.称重船，塑料盒和解剖仪器的准备 使用70%乙醇对30个称重船和30个带透明盖的小塑料盒（约0.4升）进行灭菌。 在层流罩中干燥称量管和盒子过夜（ON），并存放在封闭的塑料盒中，直到在孵育第3天进一步使用。 每30个孵化的鸡蛋灭菌2升蒸馏或去离子H2O。 通过喷洒70%乙醇对两把剪刀和三对镊子进行灭菌。将器械风干，然后将其存放在灭菌盒中，直到孵育第3天。注意：这些操作（步骤 2.1-2.4）可以在孵化第 3 天之前的任何一天完成。戴上手套以避免污染。 3.打开鸡蛋并转移到内部加湿室 注意：使用手套和口罩以避免污染。 向灭菌塑料盒中加入约50毫升灭菌的H2O。将装满水的盒子盖上盖子，以避免污染，在室温下直到使用。 在孵化第3天，使用剪刀的锋利部分破解蛋壳，并在壳上切出一个直开的口。 在称量船上手动打开蛋壳，并在称量船上收集蛋清，蛋黄及其附着的健康胚胎（图1B）。寻找一个完整的胚胎，心脏跳动，卵黄完整，并发育的血管用于实验（>95%的孵化卵）。丢弃胚胎畸形、没有心脏跳动的胚胎、蛋黄破裂或蛋黄血管受损的卵子。 轻轻地将称重船转移到内部加湿室中。注：对于步骤3.2.-3.4.，请尽可能快地工作以避免污染，如果可能，请使用层流罩。 在种蛋孵化器中孵育内部加湿室（图1C）。 使用前，从第3天到第10天在鸡蛋孵化器中培养无壳鸡蛋（参见步骤3.6.），并在需要时向培养箱中加水以保持70%的湿度。 每天通过透明塑料盖检查内部加湿室是否有死亡胚胎或受污染的无壳蛋，并将其从孵化器中取出。 4. 硅胶环的制备 为了制备硅胶环，最好使用切纸机切割内径和外径分别为4 mm和5 mm的约1 mm厚度的硅胶管（图1D）。 将硅胶环转移到小玻璃瓶上（图1D），用金属箔覆盖，并使用高压灭菌器或类似物对其进行灭菌。注意：避免重复高压灭菌可能被污染的未使用的硅胶环，因为这种处理会降低硅胶环附着在膜上的能力，随后癌细胞/胶原蛋白/ RPMI溶液泄漏到环外。 将无菌硅胶环存放在室温处。注意：此步骤可以在孵化第10天之前的任何一天完成。 5. 癌细胞的制备 注意：细胞培养基，胰蛋白酶和1x PBS等溶液储存在4°C下，在加入细胞之前应在水浴中加热至37°C。加热后，用70%乙醇冲洗瓶子并在使用前干燥。 在37°C的细胞培养箱中，在5%（v / v）CO 2存在下，在相关培养基中培养感兴趣的癌细胞系。注意：在这里，U251-GFP胶质母细胞瘤和PC-3U-GFP前列腺癌细胞在补充了10%（v / v）胎牛血清（FBS）和1%（v / v）青霉素 – 链霉素（PS）的完整RPMI培养基中培养。 计划癌细胞的培养，以便在CAM-Delam测定的孵化第10天准备收获大约50×106 个癌细胞。 每2-3天更换一次细胞培养基，或者当培养基颜色从粉红色变为橙色/黄色时。 可选：通过用CoCl2 处理癌细胞来诱导缺氧，以研究细胞收获前1天的分子机制对分层的影响。注意：氯化钴2 具有中度毒性。小心处理通风橱，并按照制造商的说明进行操作。 通过将0.0258g溶解在10 mL灭菌蒸馏H2 0中，在用铝箔包裹的15 mL锥形管中以避光，制备新鲜的20mM CoCl 2储备溶液。 在50 mL锥形管中，将250μL的20mM CoCl2 储备溶液与25mLRPMI培养基混合，补充每15cm直径细胞培养皿1%（v / v）PS（但没有FBS）。轻轻地涡旋。 从细胞培养皿中取出完整的RPMI培养基。 用灭菌的1x PBS 2x洗涤细胞。 加入25mLRPMI培养基与200μM CoCl2 细胞胰蛋白酶消化（参见步骤5.6）。 在卵子孵化第10天，准备1毫升胶原蛋白/ RPMI混合物（比例1：3），含有250μLI型胶原蛋白（5mg / mL）和750μL细胞培养RPMI培养基，补充10S和1%（v / v）PS. 将胶原蛋白/ RPMI混合物保存在冰上。 胰蛋白酶消化癌细胞以分离细胞，方法是首先除去细胞培养基并用1x PBS洗涤2x。 每15cm直径细胞培养皿加入3mL胰蛋白酶溶液（0.05%），并在细胞培养箱中孵育2-3分钟，直到细胞分离。使用桌面倒置显微镜观察分离的细胞。如果需要，轻轻敲击烧瓶的侧面以清除剩余的簇状或附着的细胞。 通过将5mL完整的RPMI培养基添加到每个细胞培养皿中来灭活胰蛋白酶，并将所有细胞培养皿中的细胞悬浮液收集到50 mL管中。 使用台盼蓝排除法对癌细胞进行计数，以使用细胞计数器区分活细胞和死细胞。将10μL细胞悬浮液加入10μL0.4%台盼蓝染色剂中。通过上下移液几次来混合样品，然后将每个腔室的10μL细胞混合物加载到细胞计数器中的样品载玻片中。重复细胞计数3x以验证细胞数/ mL。 计算并在50mL管中以500×g离心含有50 x 106活癌细胞的正确体积细胞培养悬浮液5分钟。 弃去上清液，将细胞沉淀与1mL胶原蛋白/ RPMI混合物混合。由于胶原蛋白是一种凝胶状物质，因此用1 mL移液管非常缓慢和仔细地混合细胞，以避免在形成气泡时失去细胞。 将准备好的细胞悬浮液保存在冰上，并将其带到鸡蛋工作区域。注意：避免将准备好的癌细胞保存在冰上太长时间。制备的癌细胞必须在15-25分钟内放置在CAM上。 6. 在 CAM 上接种癌细胞 注意：使用手套和口罩以避免污染。 在孵化日10，从孵化器中取出内部加湿室和孵化的无壳蛋。注意：大约可以使用孵化种蛋初始数量的90%;参见 图2。 打开内部加湿室，并使用灭菌镊子在CAM上放置最多六个硅胶环。注意：避免将硅胶环彼此靠近或靠近较大的血管。 通过移液混合癌细胞悬浮液以获得均匀分布的癌细胞，并在硅氧环内加入20μL（1×106 个细胞）制备的癌细胞悬浮液（图1E）。添加细胞时，将移液器尖端保持在CAM上方，以确保不会损坏膜。注意：根据先前的发现7，不同的癌细胞可以在同一CAM上接种在单独的环中。 关闭内部加湿室并将其放入种蛋孵化器中。 7. 与相关癌细胞分离 CAM 孵育14小时，1.5天，2.5天和3.5天后，取出约七个内部加湿室，一次打开一个盖子。 用一把剪刀，通过切割硅胶环外来解剖附着在CAM上的培养的癌细胞（所谓的CAM-Delam样品）（图1F）。 立即使用镊子将分离的CAM-Delam样品转移到培养皿中0.1M磷酸盐缓冲液（PB）中的4%多聚甲醛（PFA）中，以固定组织。保持在冰上或在4°C下保存1小时。注意：在4°C下储存4%PFA溶液最多5天。注意：PFA是有毒的。处理PFA粉末和PFA溶液时，请使用通风橱并戴上口罩和手套。避免吸入粉末或溶液蒸气。按照制造商的说明进行操作。 将鸡胚斩首，并作为生物废物丢弃在特定的垃圾箱中。 除去4%PFA溶液，并在0.1M PB中加入30%蔗糖到CAM-Delam样品中，并在4°C下平衡1小时。 在解剖显微镜下，使用镊子小心地取下硅胶环。用一把剪刀将CAM-Delam样品切成矩形，中间是癌细胞（图1G）。 用一对镊子将CAM-Delam样品转移到培养皿中的冷冻切片培养基中以除去多余的蔗糖，然后将模具嵌入冷冻切片培养基中。 在解剖显微镜下，使用任何针状仪器将CAM-Delam样品垂直方向定位在包埋模具中的U形（图1G）。 冷冻并将CAM-Delam样品储存在-80°C。 8. 切块 CAM-Delam 样品 使用冷冻切片将冷冻的CAM-Delam样品在5-6个连续载玻片上以10μm切片。 将载玻片与切片一起储存在-80°C或直接用于免疫组化染色。 9. 免疫组化染色 将载玻片从-80°C带到室温5分钟，然后开始免疫原体。 在切片结束的载玻片上用疏水标记做一条线。让它们干燥几分钟。 将载玻片置于加湿的（H2O）室中，并用〜200-500μL封闭溶液（10%胎牛血清和0.1%叠氮化钠在Tris缓冲盐水中用0.1%Triton X-100 [TBST]）覆盖切片，并孵育15-30分钟。注意：从此步骤开始，请勿在任何时候让载玻片干燥。 倒出封闭溶液，用100-150μL在封闭溶液中稀释的靶向一抗代替，并在4°C下孵育。 优选使用兔抗层粘连蛋白-111抗体来定义基底层与癌细胞标记物一起，如果不使用GFP或其它荧光标记的癌细胞系。注意：在这里，兔子抗血管性血友病因子也用于检测CAM中的血管。 准备三个装满TBST缓冲液的玻璃比色皿。 倒出一抗溶液，将载玻片转移到玻璃比色皿中，并在TBST中洗涤至少3次，每次5分钟。 用软纸巾从载玻片和疏水屏障区域去除多余的TBST。 用100-150μL合适的二次荧光抗体覆盖载玻片，该抗体在封闭溶液中稀释与4’，6-二脒基-2-苯基吲哚，二盐酸盐（DAPI）在黑暗中孵育1小时。 倒出二抗溶液，将载玻片转移到玻璃比色皿中，并在TBST中洗涤至少3次，每次5分钟。 用软纸巾从载玻片和疏水屏障区域去除多余的TBST。 通过在载玻片上滴1-2滴荧光安装介质来安装载玻片，并轻轻放置玻璃盖玻片，避免气泡。 在分析之前，让载玻片在4°C下干燥至少1小时，并将载玻片储存在4°C。 10. 显微镜成像和分层评分 使用配备数码相机的落射荧光显微镜拍摄切片，优选以10倍放大倍率拍摄（图1H）。 使用以下 CAM-Delam 评分类别分析各部分（图 3）： 寻找完整的基底板，没有明显的改变。 寻找改变但未受损的基底板。 寻找受损的基底层，不进行细胞侵袭。 寻找受损的基底层，伴有细胞侵袭。