Kanser Hücrelerinin Delaminasyon ve İnvazyon Kapasitesini Ölçerek Metastatik Özellikleri Puanlamak için CAM-Delam Testi

Özetle, Şekil 1, CAM-Delam tahlilindeki genel adımları özetlemektedir. Aşağıdaki protokol, 30 kültürlü döllenmiş tavuk yumurtasına ve üç halka / yumurtada ayrı ayrı tohumlanmış ve dört zaman noktasında analiz edilen iki farklı kanser hücresi hattının kullanımına dayanmaktadır. 1. Yumurta inkübasyonu % 90’ın üzerinde gübrelemeyi garanti eden yerel bir kuluçkahaneden döllenmiş civciv yumurtaları kullanınNOT: Yumurtalar oda sıcaklığında (RT) 4 günden fazla saklanmamalıdır. İsveç’te, embriyonik tavukların deneysel kullanımı için etik izin sadece embriyonik gün (E) 14 ve sonrasında gereklidir. Gerekirse, kuru bir kağıt havlu kullanarak veya suda ıslatarak yumurtaların üzerindeki kir veya tüyleri dikkatlice mekanik olarak silin. Yumurta inkübatörünü kullanmadan önce% 70 etanol ile temizleyin ve sterilize edin (her seferinde). İstenilen sayıda yumurtayı yumurta tepsilerine yerleştirin ve civciv yumurtalarını yatay olarak bir yumurta inkübatöründe 37.5-38 ° C’de% 70 nem oranıyla inkübe edin. Bunu kuluçka günü 0 olarak düşünün (Şekil 1A). 2. Tartım teknesinin, plastik kutuların ve diseksiyon cihazlarının hazırlanması 30 tartım teknesini ve şeffaf kapaklı 30 küçük plastik kutuyu (~0,4 L) sterilize etmek için etanol kullanın. Tartım teknelerini ve kutularını gece boyunca laminer bir davlumbazda (AÇIK) kurutun ve 3. kuluçka gününde bir sonraki kullanıma kadar kapalı plastik bir kutuda saklayın. 30 kuluçkalanmış yumurta başına 2 L damıtılmış veya deiyonizeH2O sterilize edin. % 70 etanol püskürterek iki çift makas ve üç çift forseps sterilize edin. Aletleri hava ile kurutun ve daha sonra inkübasyon 3. güne kadar sterilize edilmiş bir kutuda saklayın.NOT: Bu eylemler (Adım 2.1-2.4) inkübasyon günü 3’ten önceki herhangi bir gün yapılabilir. Kirlenmeyi önlemek için eldiven kullanın. 3. Yumurtaların açılması ve iç nemlendirilmiş odaya aktarılması NOT: Kontaminasyonu önlemek için eldiven ve yüz maskesi kullanın. Sterilize plastik kutulara yaklaşık 50 mL sterilizeH2O ekleyin. Kirlenmeyi önlemek için kapakları kapalı su dolu kutuları kullanıma kadar RT’de tutun. Kuluçka günü 3’te, makasın keskin kısmını kullanarak yumurta kabuğunu kırın ve kabukta düz bir açıklık kesin. Yumurta kabuğunu bir tartım teknesinin üzerinde manuel olarak kırın ve yumurta akını, yumurta sarısını ve ekli sağlıklı embriyosunu tartım teknesinde toplayın (Şekil 1B). Deney için atan bir kalbe, sağlam bir yumurta sarısına ve gelişmiş kan damarlarına sahip sağlam bir embriyo arayın (inkübe edilmiş yumurtaların% >95’i). Hatalı biçimlendirilmiş bir embriyoya sahip yumurtaları, atan kalbi olmayan bir embriyoyu, kırık bir yumurta sarısını veya hasarlı yumurta sarısı kan damarlarını atın. Tartım teknesini yavaşça nemlendirilmiş bir iç odaya aktarın.NOT: Adım 3.2.-3.4. için, kontaminasyonu önlemek için mümkün olduğunca hızlı çalışın ve mümkünse laminer bir başlık kullanın. Yumurta inkübatöründe iç nemlendirilmiş odayı inkübe edin (Şekil 1C). Kabuksuz yumurtaları kullanılmadan önce yumurta inkübatöründe 3. günden 10. güne kadar kültürleyin (bakınız Adım 3.6.) ve gerektiğinde,% 70 nemi korumak için inkübatöre su ekleyin. Dahili nemlendirilmiş odaları, ölü embriyolar veya kontamine kabuksuz yumurtalar için şeffaf plastik kapaktan her gün kontrol edin ve inkübatörden çıkarın. 4. Silikon halkaların hazırlanması Silikon halkalar hazırlamak için, tercihen bir kağıt kesici kullanarak, ~ 1 mm kalınlığında, sırasıyla 4 mm ve 5 mm iç ve dış çapa sahip bir silikon tüp kesin (Şekil 1D). Silikon halkaları küçük cam şişelere aktarın (Şekil 1D), metal folyo ile örtün ve bir otoklav veya benzeri bir şey kullanarak sterilize edin.NOT: Kirlenmiş olabilecek kullanılmayan silikon halkaların tekrar tekrar otoklavlanmasından kaçının, çünkü bu tür bir işlem silikon halkaların membrana yapışma kapasitesini azaltır ve ardından kanser hücresi / kollajen / RPMI çözeltisinin halkaların dışına sızması. Steril silikon halkaları RT’de saklayın.NOT: Bu adım, inkübasyon günü 10’dan önceki herhangi bir gün yapılabilir. 5. Kanser hücrelerinin hazırlanması NOT: Hücre kültürü ortamı, tripsin ve 1x PBS gibi çözeltiler 4 °C’de depolanır ve hücrelere eklenmeden önce bir su banyosunda 37 °C’ye ısıtılmalıdır. Isıtmadan sonra, şişeleri% 70 etanol içinde durulayın ve kullanmadan önce kurulayın. Kültür Kanser hücresi hatları, 37 ° C’de bir hücre kültürü inkübatöründe% 5 (v / v) CO2 varlığında ilgili kültür ortamına ilgi duyar.NOT: Burada, U251-GFP glioblastoma ve PC-3U-GFP prostat kanseri hücreleri,% 10 (v / v) fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 (v / v) penisilin-streptomisin (PS) ile desteklenmiş tam RPMI orta-RPMI ortamında kültürlendi. Kanser hücrelerinin kültürünü, yaklaşık 50 × 106 kanser hücresinin CAM-Delam testinin kuluçka günü 10’unda hasat için hazır olacak şekilde planlayın. Hücre kültürü ortamını her 2-3 günde bir veya orta renk pembeden turuncu / sarıya değiştiğinde değiştirin. İsteğe bağlı: Hücre hasadından 1 gün önce delaminasyon üzerindeki moleküler mekanik etkileri araştırmak için kanser hücrelerini CoCl2 ile tedavi ederek hipoksiye neden olun.DİKKAT: CoCl2 orta derecede toksisiteye sahiptir. Bir duman davlumbazında dikkatli bir şekilde kullanın ve üreticinin talimatlarını izleyin. Işıktan korumak için alüminyum folyo ile sarılmış 15 mL konik bir tüp içinde 0,0258 g’ı 10 mL sterilize edilmiş damıtılmış H 2 0 0 içinde çözerek taze20mM CoCl 2stok çözeltisi hazırlayın. 50 mL’lik bir konik tüpte, 20 mM CoCl 2 stok çözeltisinin250 μL’sini, 15 cm çapında hücre kültürü kabı başına% 1 (v / v) PS (ancak FBS olmadan) ile desteklenmiş 25 mL RPMI ortamında karıştırın. Vorteks nazikçe girdap. RPMI ortamının tamamını hücre kültürü bulaşıklarından çıkarın. Hücreleri sterilize edilmiş 1x PBS 2x ile yıkayın. 200 μM CoCl 2 hücre tripsinizasyonu ile25 mL RPMI ortamı ekleyin (bkz. Adım 5.6). Yumurta kuluçka günü 10’da, 250 μL tip I kollajen (5 mg / mL) ve 750 μL hücre kültürü RPMI ortamı içeren% 10 FBS ve% 1 (v / v) PS ile desteklenmiş 1 mL kollajen / RPMI karışımı (oran 1: 3) hazırlayın. Önce hücre kültürü ortamını çıkararak hücreleri izole etmek için kanser hücrelerini tripsinize edin ve 2x’i 1x PBS ile yıkayın. 15 cm çapında hücre kültürü kabı başına 3 mL tripsin çözeltisi (% 0.05) ekleyin ve hücreler ayrılana kadar bir hücre kültürü inkübatöründe 2-3 dakika inkübe edin. Ayrılmış hücreleri görmek için masa üstü, ters çevrilmiş bir mikroskop kullanın. Gerekirse, kalan kümelenmiş veya bağlı hücreleri yerinden çıkarmak için şişenin yan tarafına hafifçe dokunun. Her hücre kültürü kabına 5 mL tam RPMI ortamı ekleyerek tripsini etkisiz hale getirin ve tüm hücre kültürü kaplarından hücre süspansiyonunu 50 mL’lik bir tüpe toplayın. Bir hücre sayacı kullanarak canlı hücreleri ölü hücrelerden ayırt etmek için Trypan Blue dışlama yöntemiyle kanser hücrelerini sayın. 10 μL hücre süspansiyonunu% 0.4 tripan mavisi lekesinin 10 μL’sine ekleyin. Numuneyi birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek, karıştırın ve ardından oda başına 10 μL hücre karışımını hücre sayacındaki numune slaytına yükleyin. Hücre numarasını/mL’yi doğrulamak için hücre sayımını 3x tekrarlayın. 50 dakika boyunca 500 × g’da 50 mL’lik bir tüpte 50 x 106 canlı kanser hücresi içeren doğru hacimli hücre kültürü süspansiyonunu hesaplayın ve santrifüj edin. Süpernatantı atın ve hücre peletini 1 mL kollajen / RPMI karışımı ile karıştırın. Kollajen jelatinimsi bir malzeme olduğundan, kabarcık oluşumunda hücreleri kaybetmemek için hücreleri 1 mL’lik bir pipetle çok yavaş ve dikkatli bir şekilde karıştırın. Hazırlanan hücre süspansiyonunu buz üzerinde tutun ve yumurta çalışma alanına getirin.NOT: Hazırlanan kanser hücrelerini buz üzerinde çok uzun süre tutmaktan kaçının. Hazırlanan kanser hücreleri 15-25 dakika içinde TAT üzerine yerleştirilmelidir. 6. Kanser hücrelerinin CAM üzerine tohumlanması NOT: Kontaminasyonu önlemek için eldiven ve yüz maskesi kullanın. Kuluçka günü 10’da, inkübatörden inkübe edilmiş kabuksuz yumurtalarla iç nemlendirilmiş odaları çıkarın.NOT: Kuluçkalanan yumurtaların başlangıç sayısının yaklaşık% 90’ı kullanılabilir; Bkz. Şekil 2. Dahili nemlendirilmiş odayı açın ve sterilize forseps kullanarak CAM üzerine altı adede kadar silikon halka yerleştirin.NOT: Silikon halkaları birbirine yakın veya daha büyük kan damarlarına yakın yerleştirmekten kaçının. Kanser hücrelerinin eşit dağılımını elde etmek için pipetleme ile kanser hücresi süspansiyonunu karıştırın ve hazırlanan kanser hücresi süspansiyonunun 20 μL’sini (1 × 106 hücre) bir silikon halka içine ekleyin (Şekil 1E). Hücreleri eklerken, membrana zarar vermediğinden emin olmak için pipet ucunu CAM’ın üzerinde tutun.NOT: Önceki bulgulara göre7, farklı kanser hücreleri aynı TAT üzerinde ayrı halkalar halinde tohumlanabilir. İç nemlendirilmiş odayı kapatın ve yumurta inkübatörüne koyun. 7. TAT’ın ilişkili kanser hücreleri ile izolasyonu 14 saat, 1,5 gün, 2,5 gün ve 3,5 günlük inkübasyondan sonra, yaklaşık yedi iç nemlendirilmiş odayı çıkarın ve kapakları birer birer açın. Bir çift makasla CAM’a bağlı kültürlenmiş kanser hücrelerini (CAM-Delam örnekleri olarak adlandırılır) silikon halkanın dışına keserek diseke edin (Şekil 1F). Forseps kullanarak izole edilmiş CAM-Delam numunesini, dokunun sabitlenmesi için bir Petri kabında 0.1 M fosfat tamponunda (PB) % 4 paraformaldehit’e (PFA) derhal aktarın. 1 saat boyunca buzda veya 4 ° C’de tutun.NOT: %4 PFA çözeltisini maksimum 5 gün boyunca 4 °C’de saklayın. DİKKAT: PFA toksiktir. PFA tozu ve PFA çözeltilerini kullanırken, bir duman başlığı kullanın ve bir yüz maskesi ve eldiven takın. Toz veya çözelti buharlarını solumaktan kaçının. Üreticinin talimatlarını izleyin. Tavuk embriyolarının kafasını kesin ve biyolojik atık olarak belirli kutulara atın. %4’lük PFA çözeltisini çıkarın ve CAM-Delam numunelerine 0,1 M PB’de sakkaroz ekleyin ve 1 saat boyunca 4 °C’de dengeleyin. Bir diseksiyon mikroskobu altında, forseps kullanarak silikon halkayı dikkatlice çıkarın. Bir çift makasla CAM-Delam örneğini ortadaki kanser hücreleri ile dikdörtgen şeklinde kesin (Şekil 1G). Bir çift forseps ile, fazla sakkarozu çıkarmak için CAM-Delam numunelerini bir Petri kabındaki dondurulmuş kesit ortamına aktarın ve ardından kalıpları dondurulmuş kesit ortamına gömün. Bir diseksiyon mikroskobu altında, CAM-Delam numunesini, iğne benzeri herhangi bir alet kullanarak gömme kalıplarında dikey yönde bir U-şeklinde konumlandırın (Şekil 1G). CAM-Delam numunelerini dondurun ve −80 °C’de saklayın. 8. CAM-Delam örneklerinin bölümlenmesi Dondurulmuş CAM-Delam numunelerini kriyoseksiyon kullanarak 5-6 ardışık slaytta 10 μm’de kesitleyin. Slaytları kesitlerle -80 °C’de saklayın veya doğrudan immünohistokimya boyama için kullanın. 9. İmmünohistokimya boyama İmmünoprotokole başlamadan önce slaytları -80 °C’den RT’ye 5 dakika boyunca getirin. Bölümlerin bittiği slaytlarda hidrofobik bir işaretleyici ile bir çizgi oluşturun. Birkaç dakika kurumasını bekleyin. Slaytları nemlendirilmiş (H2O) bir odaya yerleştirin ve bölümleri ~ 200-500 μL bloke çözeltisi (% 10 fetal buzağı serumu ve% 0.1 Triton X-100 [TBST] ile Tris tamponlu salinde % 0.1 sodyum azid) ile örtün ve 15-30 dakika inkübe edin.NOT: Bu adımdan itibaren, slaytların hiçbir zaman kurumasına izin vermeyin. Bloke edici çözeltiyi dökün ve bloke edici çözeltide seyreltilmiş 100-150 μL birincil antikor ile değiştirin ve 4 ° C’de AÇIK’ı inkübe edin. GFP veya diğer floresan etiketli kanser hücre hatları kullanılmıyorsa, bazal laminayı bir kanser hücresi belirteci ile birlikte tanımlamak için tercihen tavşan anti-laminin-111 antikoru kullanın.NOT: Burada, CAM’deki kan damarlarını tespit etmek için bir tavşan anti-von Willebrand Faktörü de kullanılmıştır. TBST tamponu ile doldurulmuş üç cam küvet hazırlayın. Birincil antikor çözeltisini dökün, slaytları cam küvetlere aktarın ve TBST’de her biri 5 dakika boyunca en az 3x yıkayın. Fazla TBST’yi slayttan ve hidrofobik bariyer bölgesinden yumuşak bir kağıt mendille çıkarın. Slaytı, 4′,6-diamidino-2-fenilindol, dihidroklorür (DAPI) ile kombine edilmiş blokaj çözeltisinde seyreltilmiş uygun bir ikincil floresan antikorun 100-150 μL ile örtün ve 1 saat boyunca RT’de karanlıkta inkübe edin. İkincil antikor çözeltisini dökün, slaytları cam küvetlere aktarın ve TBST’de her biri 5 dakika boyunca en az 3x yıkayın. Fazla TBST’yi slayttan ve hidrofobik bariyer bölgesinden yumuşak bir kağıt mendille çıkarın. Slaytın üzerine 1-2 damla floresan montaj ortamı koyarak slaytları monte edin ve hava kabarcıklarını önleyerek yavaşça bir cam kapak kayması yerleştirin. Analiz etmeden önce slaytları 4 °C’de en az 1 saat kurumaya bırakın ve slaytları 4 °C’de saklayın. 10. Mikroskopi görüntüleme ve delaminasyon skorlaması Bölümleri, tercihen 10x büyütmede dijital kamera ile donatılmış bir epifloresan mikroskop kullanarak fotoğraflayın (Şekil 1H). Aşağıdaki CAM-Delam puanlama kategorilerini kullanarak bölümleri analiz edin (Şekil 3): Gözle görülür değişiklikler olmadan sağlam bazal lamina arayın. Değişmiş ancak hasar görmemiş bazal laminayı arayın. Hücre invazyonu olmadan hasarlı bazal laminayı arayın. Hücre invazyonu ile hasarlı bazal lamina arayın.