Uso de pinzas ópticas duales y microfluídica para estudios de moléculas individuales

La capacidad de visualizar las interacciones proteína-ADN a nivel de molécula única y en tiempo real ha proporcionado información significativa sobre la estabilidad del genoma ^1,2. Además de trabajar con moléculas individuales de ADN de una en una, la capacidad de ver las transacciones entre moléculas individuales cercanas proporciona información adicional ^3,4,5. La manipulación de moléculas de ADN adicionales requiere tanto trampas ópticas adicionales como células de flujo microfluídico multicanal de alta calidad⁶.

Hay varios métodos disponibles para generar más de una trampa óptica. Estos incluyen espejos de escaneo galvanómetro, moduladores ópticos acústicos y óptica difractiva, que generan pinzas ópticas holográficas 4,7,8,9. A menudo, los espejos de escaneo y los moduladores ópticos acústicos producen trampas de tiempo compartido. En la configuración descrita aquí, el haz de un solo láser Nd: YAG se divide en la polarización, y luego los espejos de escaneo láser del galvanómetro controlan la posición de lo que se denomina la trampa móvil (Figura 1) ⁴. Para facilitar el posicionamiento de espejos y filtros para dirigir el haz de atrapamiento a la abertura posterior del objetivo del microscopio, se utiliza un láser HeNe. Esto facilita la alineación general, ya que el haz HeNe es visible a simple vista, mientras que los rayos infrarrojos no lo son. El haz HeNe también es más seguro para trabajar con lo que hace que el posicionamiento de los espejos y otros componentes sea menos estresante. Inicialmente, la trayectoria del haz para este láser está separada del haz de 1064 nm, pero se introduce en la misma trayectoria del haz y luego en el objetivo del microscopio. Una vez que se logra la alineación física, se realiza el posicionamiento del haz de 1064 nm en la parte superior del haz HeNe y esto se facilita mediante el uso de un visor infrarrojo y varias herramientas de imágenes de haz para visualizar la posición y la calidad del haz. Luego, se introduce el expansor de haz y el haz infrarrojo expandido resultante se alinea en la abertura posterior del objetivo. Finalmente, se retira el objetivo y la potencia en cada haz polarizado se mide y ajusta utilizando placas de onda λ/2 para que sea igual (Figura 1C). Las mediciones de potencia también se realizan una vez que se devuelve el objetivo y, por lo general, hay una pérdida de potencia del 53%. Sin embargo, hay suficiente potencia para formar trampas ópticas fijas y móviles estables en el plano focal (Figura 1D).

Para obtener imágenes de las transacciones de ADN, las células de flujo microfluídico desempeñan un papel clave, ya que permiten mediciones controladas a nivel de molécula única con alta resolución espacial y temporal (Figura 2). El término microfluídico se refiere a la capacidad de manipular fluidos en uno o más canales con dimensiones que van desde 5-500 μm^10,11. El término corriente se refiere al fluido real dentro de un canal y el canal se refiere al canal físico en el que se mueve una corriente o corrientes de fluido. El diseño de celda de flujo de un solo canal tiene un canal físico común donde se observan las reacciones y, por lo general, solo hay una corriente de fluido presente. Por lo tanto, estos diseños se conocen como células de flujo de flujo único. En contraste, las células de flujo múltiple se definen como un dispositivo microfluídico en el que dos o más canales de entrada convergen en un solo canal físico común (Figura 2A). Dentro del canal común, las corrientes de fluido que se originan en los canales individuales fluyen paralelas entre sí, y permanecen separadas con una mezcla mínima entre ellas debido a la difusión (Figura 2B). En la mayoría de las configuraciones experimentales, una sola bomba empuja fluidos en cada canal a la misma velocidad. Por el contrario, cuando se utiliza la dirección límite, tres o más bombas controladas independientemente empujan los fluidos a través de los canales. Sin embargo, cada bomba funciona a una velocidad diferente, pero el caudal neto en el canal común es constante¹². Esto permite el intercambio rápido de los componentes del canal principal simplemente alterando la velocidad de la bomba.

Además del flujo laminar, otro factor crítico es el perfil de velocidad parabólica dentro de la corriente de fluido laminar. La velocidad de flujo más alta ocurre en el medio de la corriente y la más lenta ocurre junto a las superficies (Figura 2C)¹³. Se debe considerar que este perfil estira completamente una molécula de ADN que está unida a una cuenta sostenida en la corriente para una visualización precisa del ADN fluorescente y análisis precisos de una sola molécula. Aquí, el ADN se estira a la forma B y se mantiene en su lugar bajo 0 pN de fuerza. Para lograr esto, el enfoque de la posición de la trampa óptica debe ser a una posición de 10-20 μm de la superficie del cubreobjetos inferior (Figura 2D). Se debe tener cuidado para que la molécula de ADN no se estire más allá de la forma B, ya que esto puede inhibir las reacciones enzimáticas. En condiciones típicas de amortiguación, 1 μm = 3.000 pb de ADN¹⁴. Además, al atrapar 10-20 μm del cubreobjetos, el complejo de ADN se coloca lejos de la superficie, minimizando así las interacciones superficiales.

Se han utilizado muchos métodos para crear canales de dispositivos microfluídicos y estos se pueden hacer en el laboratorio o las células de flujo se pueden comprar de fuentes comerciales 6,15,16,17. Los materiales óptimos utilizados para construir las células de flujo deben ser mecánicamente rígidos, ópticamente transparentes con baja fluorescencia e impermeables a los disolventes orgánicos⁶. Con frecuencia, el vidrio flotado de borosilicato o sílice fundida se utilizan para proporcionar un entorno de flujo estable durante un tiempo prolongado que es adecuado para la captura óptica, la visualización y la detección de fuerza. Estos materiales también permiten el uso de solventes no acuosos (por ejemplo, metanol de grado espectrofotométrico) para simplificar la humectación de la superficie y la eliminación de burbujas de aire, y desnaturalizantes (por ejemplo, clorhidrato de guanidinio 6M) o detergentes para limpiar la celda de flujo. Finalmente, los métodos utilizados para introducir fluidos en las celdas de flujo varían desde complejos sistemas de bombas de vacío hasta bombas de una sola jeringa 14,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. En el enfoque descrito aquí, se utiliza una bomba de jeringa que puede acomodar hasta 10 jeringas (Figura 3A). Esto proporciona flexibilidad para usar celdas de flujo de un solo canal o celdas de flujo con múltiples canales de entrada. Aquí, se utiliza una celda de flujo de tres canales y se acopla a jeringas mantenidas en su lugar en la bomba de jeringa utilizando tubos de poli-éter-éter-cetona (PEEK) (Figura 3A-C). El flujo de fluidos es controlado por válvulas de conmutación de cuatro vías y, por lo tanto, sirven para minimizar la introducción de burbujas en la celda de flujo (Figura 3A, D). Además, se recomiendan las jeringas estancas al gas Hamilton que tienen paredes de vidrio rígido y émbolos recubiertos de politetrafluoroetileno (PTFE), ya que proporcionan un movimiento de émbolo excepcionalmente suave que es esencial para obtener un flujo suave^14,27.

En el sistema experimental descrito, se han utilizado células de flujo con dos a cinco canales de entrada. El número de canales de entrada está dictado por el experimento que se está realizando. Para el estudio de RecBCD y Hop2-Mnd1, dos canales de corriente fueron suficientes^14,28. Para la helicasa, la enzima se unió al extremo libre del ADN y se tradujo en una corriente que contiene magnesio y ATP para iniciar la translocación y el desenrollamiento. Para Hop2-Mnd1, el ADN atrapado ópticamente se tradujo en la corriente de fluido adyacente que contiene proteínas y amortiguador ± iones metálicos divalentes. El uso de células de flujo de tres canales permite atrapar el ADN en la corriente 1, traducir el ADN en la corriente 2 para permitir que ocurra la unión a las proteínas, y luego a la corriente 3 donde el ATP está presente, por ejemplo, para iniciar reacciones. Una variación de lo anterior es usar proteína marcada con fluorescencia en el canal 2, lo que hace que la corriente de fluido sea completamente blanca e impide la visualización del ADN. Cuando esta molécula se traduce en la corriente 3, tanto las proteínas como el ADN son ahora visibles cuando se inician las reacciones.

El uso de válvulas de conmutación de cuatro vías para controlar el flujo de fluido es un componente crítico del sistema para eliminar las burbujas en las celdas de flujo. Las burbujas son perjudiciales para el flujo estable de fluidos, ya que se contraen y expanden de manera impredecible, lo que resulta en cambios rápidos en la velocidad del flujo y la introducción de turbulencias. Cuando las válvulas se colocan entre las jeringas y el tubo de entrada, la trayectoria del flujo se desconecta cambiando la posición de la válvula cuando se cambian las jeringas. Cuando se coloca la nueva jeringa, el émbolo se puede presionar manualmente para expulsar >6 μL (el volumen muerto de la válvula) y esto elimina las burbujas casi por completo.

La fijación de conectores a las celdas de flujo es con frecuencia el paso limitante de la velocidad en el uso de la celda de flujo. Describimos el uso de dos tipos de conectores: extraíbles conocidos como press-fit y permanentes (conjuntos de nanopuertos). Los conectores extraíbles son fáciles de adherir a una celda de flujo y se pueden probar diferentes tipos de tubos flexibles además del PTFE recomendado con estos conectores. Esta es una forma rápida y rentable de probar tubos y conectores sin sacrificar celdas de flujo de vidrio más caras. En contraste, los ensamblajes de nanopuertos están unidos permanentemente, soportan presiones de hasta 1,000 psi y, en nuestras manos, su uso está restringido a tubos PEEK de diferentes diámetros. Esto no es una desventaja, ya que preferiblemente se utiliza un tubo PEEK. Una sola celda de flujo de vidrio con ensamblajes permanentes unidos se puede reutilizar durante más de 1 año con un uso cuidadoso.