使用双光镊和微流体进行单分子研究

在单分子水平上实时可视化蛋白质-DNA相互作用的能力为基因组稳定性提供了重要的见解^1，2。除了一次处理一个DNA分子外，查看附近单个分子之间的交易的能力还提供了额外的洞察力³，^4，5。操纵额外的DNA分子既需要额外的光学陷阱，也需要高质量的多通道微流体流通池⁶。

有几种方法可用于生成多个光学陷阱。这些包括振镜扫描镜、声光调制器和衍射光学器件，它们产生全息光镊⁴，⁷，^8，9。通常，扫描镜和声光调制器会产生分时陷阱。在这里描述的设置中，单个Nd：YAG激光器的光束在偏振上分裂，然后振镜激光扫描镜控制所谓的移动陷阱的位置（图1）⁴。为了便于定位反射镜和滤光片，将捕获光束引导到显微镜物镜的后孔径，使用了HeNe激光器。这使得整体对准更容易，因为HeNe光束是肉眼可见的，而红外光束则不是。氦氖光束也更安全，可以减轻镜子和其他组件的定位压力。最初，该激光器的光束路径与1064 nm光束分开，但被引入相同的光束路径，然后进入显微镜物镜。一旦实现物理对准，就可以将 1064 nm 光束定位在 HeNe 光束的顶部，这可以通过使用红外观察器和各种光束成像工具来可视化光束位置和质量来实现。然后，引入扩束镜，并将所得的扩增红外光束对准物镜的后孔径。最后，移除物镜，并使用λ/2波片测量和调整每个偏振光束中的功率以使其相等（图1C）。返回物镜后也会进行功率测量，通常有53%的功率损耗。然而，有足够的功率在焦平面中形成稳定的固定和移动光学陷阱（图1D）。

为了对DNA交易进行成像，微流体流通池起着关键作用，因为它们允许在单分子水平上进行具有高空间和时间分辨率的受控测量（图2）。术语微流体是指在一个或多个通道中操纵流体的能力，尺寸范围为5-500μm^10，11。术语流是指通道内的实际流体，通道是指一个或多个流体流在其中移动的物理通道。单通道流通池设计具有一个通用的物理通道，用于观察反应，并且通常仅存在一个流体流。因此，这些设计被称为单流流通池。相比之下，多流流通池被定义为一种微流体装置，其中两个或多个入口通道汇聚成一个公共物理通道（图2A）。在公共通道内，源自各个通道的流体流彼此平行流动，并保持分离，由于扩散，它们之间的混合很小（图2B）。在大多数实验设置中，单个泵以相同的速度将流体推入每个通道。相反，当使用边界转向时，三个或更多独立控制的泵将流体推动通过通道。然而，每个泵以不同的速度运行，但公共通道中的净流量恒定为¹²。这允许通过改变泵速来快速更换主通道组件。

除了层流，另一个关键因素是层流内的抛物线速度分布。最高流速出现在流的中间，最慢的流速出现在表面旁边（图2C）¹³。必须考虑该谱图以完全拉伸附着在流中的磁珠上的DNA分子，以实现荧光DNA的精确可视化和准确的单分子分析。在这里，DNA被拉伸到B形式，并在0pN的力下保持在适当的位置。为此，光学陷阱位置的聚焦应位于距底部盖玻片表面10-20μm的位置（图2D）。必须注意使DNA分子不会拉伸到B型以上，因为这会抑制酶反应。在典型的缓冲条件下，1 μm = 3，000 bp 的 DNA¹⁴。此外，通过从盖玻片捕获10-20μm，DNA复合物远离表面，从而最大限度地减少表面相互作用。

许多方法已被用于创建微流体设备通道，这些可以在实验室中完成，或者可以从商业来源购买^流通池6，¹⁵，^16，17。用于构建流通池的最佳材料必须是机械刚性、低荧光的光学透明和不受有机溶剂的影响⁶。通常，硼硅酸盐浮法玻璃或熔融石英用于长时间提供稳定的流动环境，适用于光学捕获、可视化和力检测。这些材料还允许使用非水溶剂（例如分光光度级甲醇）来简化表面润湿和去除气泡，并使用变性剂（例如6M盐酸胍）或洗涤剂来清洁流通池。最后，用于将流体引入流通池的方法从复杂的真空泵系统到单注射泵¹⁴，¹⁸，¹⁹，20，²¹，^22，23，²⁴，²⁵，^26，27。在这里描述的方法中，使用最多可容纳10个注射器的注射泵（图3A）。这为使用单通道流通池或具有多个入口通道的流通池提供了灵活性。在这里，使用三通道流通池，并使用聚醚醚酮（PEEK）管与注射泵上固定的注射器配合使用（图3A-C）。流体的流动由四通切换阀控制，从而最大限度地减少气泡进入流通池（图3A，D）。此外，建议使用具有坚硬玻璃壁和聚四氟乙烯（PTFE）涂层柱塞的汉密尔顿气密注射器，因为它们提供异常平稳的柱塞运动，这对于获得平稳的流动至关重要^14，27。

在所描述的实验系统中，使用了具有两到五个入口通道的流通池。入口通道的数量由正在进行的实验决定。对于RecBCD和Hop2-Mnd1的研究，两个流道就足够了^14，28。对于解旋酶，酶与DNA的自由端结合并翻译成含有镁和ATP的流以启动易位和解开。对于Hop2-Mnd1，光学捕获的DNA被翻译成含有蛋白质和缓冲液的相邻流体流±二价金属离子。使用三通道流通池可以捕获流1中的DNA，将DNA翻译成流2以允许蛋白质结合发生，然后在存在ATP的情况下将DNA翻译成流3，例如启动反应。上述方法的变体是在通道2中使用荧光标记的蛋白质，这导致流体流完全白色并排除DNA的可视化。当该分子被翻译成流3时，当反应开始时，蛋白质和DNA现在都可见。

使用四通切换阀来控制流体流量是消除流通池中气泡的系统的关键组成部分。气泡不利于稳定的流体流动，因为它们以不可预测的方式收缩和膨胀，导致流速快速变化并引入湍流。当阀门位于注射器和入口管之间时，当更换注射器时，通过切换阀门位置来断开流路。当新注射器就位时，可以手动压下柱塞，以便喷射出>6μL（阀门的死体积），这几乎完全消除了气泡。

将连接器连接到流通池通常是流通池使用中的限速步骤。我们描述了两种类型的连接器的使用：称为压接的可拆卸连接器和永久连接器（纳米端口组件）。可拆卸连接器易于粘附在流通池上，除了推荐的PTFE外，还可以使用这些连接器测试不同类型的柔性管。这是一种快速且经济高效的方法来测试管道和连接器，而不会牺牲更昂贵的玻璃流通池。相比之下，纳米端口组件是永久连接的，可承受高达1，000 psi的压力，并且在我们手中，它们的使用仅限于不同直径的PEEK管。这不是缺点，因为最好使用PEEK管。连接有永久组件的单个玻璃流通池可以重复使用 1 年以上，小心使用。