استخدام الملقط البصري المزدوج والموائع الدقيقة للدراسات أحادية الجزيء
Özet
يتم تسهيل الكيمياء الحيوية البصرية أحادية الجزيء التي تمت دراستها من خلال غرف الموائع الدقيقة بشكل كبير باستخدام برميل زجاجي ، ومحاقن مانعة لتسرب الغاز ، ووصلات مستقرة للأنابيب بخلايا التدفق ، والقضاء على الفقاعات عن طريق وضع صمامات التبديل بين المحاقن والأنابيب. يصف البروتوكول الفخاخ البصرية المزدوجة التي تمكن من تصور معاملات الحمض النووي والتفاعلات بين الجزيئات.
Abstract
الكيمياء الحيوية البصرية هي تقنية قوية لمراقبة الخصائص العشوائية للإنزيمات المفردة أو مجمعات الإنزيم التي يتم حجبها في المتوسط الذي يحدث في دراسات المرحلة السائبة. لتحقيق التصور ، يتم تركيز الملقط البصري المزدوج ، حيث يتم تثبيت أحد المصيدة والآخر متحرك ، في قناة واحدة لغرفة الموائع الدقيقة متعددة التيارات الموضوعة على مرحلة مجهر مضان مقلوب. تحبس الملقط البصري جزيئات مفردة من الحمض النووي المسمى بالفلورسنت وتدفق السوائل عبر الغرفة وتتجاوز الخرز المحبوس ، وتمتد الحمض النووي إلى شكل B (تحت الحد الأدنى من القوة ، أي 0 pN) مع ملاحظة الحمض النووي كخيط أبيض على خلفية سوداء. يتم نقل جزيئات الحمض النووي من تيار إلى آخر ، عن طريق ترجمة المرحلة المتعامدة مع التدفق لتمكين بدء التفاعلات بطريقة خاضعة للرقابة. لتحقيق النجاح ، يتم تزاوج أجهزة الموائع الدقيقة ذات القنوات الواضحة بصريا مع المحاقن الزجاجية المثبتة في مكانها في مضخة حقنة. تستخدم النتائج المثلى الموصلات المرتبطة بشكل دائم بخلية التدفق ، وهي أنابيب صلبة ميكانيكيا ومقاومة كيميائيا ، ومتصلة بصمامات التبديل التي تقضي على الفقاعات التي تمنع التدفق الصفحي.
Introduction
قدمت القدرة على تصور تفاعلات البروتين والحمض النووي على مستوى الجزيء الواحد وفي الوقت الفعلي نظرة ثاقبة مهمة لاستقرار الجينوم 1,2. بالإضافة إلى العمل مع جزيئات مفردة من الحمض النووي واحدا تلو الآخر ، فإن القدرة على عرض المعاملات بين الجزيئات الفردية القريبة توفر رؤية إضافية3،4،5. يتطلب التلاعب بجزيئات الحمض النووي الإضافية كلا من الفخاخ البصرية الإضافية بالإضافة إلى خلايا تدفق الموائع الدقيقة عالية الجودة ومتعددة القنوات6.
هناك العديد من الطرق المتاحة لإنشاء أكثر من مصيدة بصرية واحدة. وتشمل هذه مرايا مسح الجلفانومتر ، ومعدلات البصريات الصوتية ، والبصريات الحيود ، والتي تولد ملاقط بصرية ثلاثية الأبعاد4،7،8،9. في كثير من الأحيان ، تنتج مرايا المسح الضوئي والمعدلات البصرية الصوتية مصائد تشارك بالوقت. في الإعداد الموضح هنا ، يتم تقسيم شعاع ليزر Nd: YAG واحد على الاستقطاب ، ثم تتحكم مرايا المسح الضوئي بالليزر الجلفانومتر في موضع ما يسمى بالمصيدة المتنقلة (الشكل 1) 4. لتسهيل وضع المرايا والمرشحات لتوجيه شعاع الاصطياد إلى الفتحة الخلفية لهدف المجهر ، يتم استخدام ليزر HeNe. هذا يجعل المحاذاة الكلية أسهل لأن شعاع HeNe مرئي للعين المجردة ، في حين أن أشعة الأشعة تحت الحمراء ليست كذلك. يعد شعاع HeNe أيضا أكثر أمانا للعمل مع جعل وضع المرايا والمكونات الأخرى أقل إرهاقا. في البداية ، يكون مسار شعاع هذا الليزر منفصلا عن شعاع 1064 نانومتر ، ولكن يتم إدخاله في نفس مسار الحزمة ، ثم في هدف المجهر. بمجرد تحقيق المحاذاة المادية ، يتم وضع شعاع 1064 نانومتر أعلى شعاع HeNe ويتم تسهيل ذلك من خلال استخدام عارض الأشعة تحت الحمراء وأدوات تصوير الحزمة المختلفة لتصور موضع الحزمة وجودتها. بعد ذلك ، يتم إدخال موسع الحزمة ، ويتم محاذاة شعاع الأشعة تحت الحمراء الموسع الناتج على الفتحة الخلفية للهدف. أخيرا ، تتم إزالة الهدف ويتم قياس القدرة في كل حزمة مستقطبة وتعديلها باستخدام ألواح موجية λ / 2 لتكون متساوية (الشكل 1C). يتم إجراء قياسات الطاقة أيضا بمجرد إرجاع الهدف وعادة ما يكون هناك فقدان للطاقة بنسبة 53٪. ومع ذلك ، هناك طاقة كافية لتشكيل مصائد بصرية ثابتة ومتحركة مستقرة في المستوى البؤري (الشكل 1D).
لتصوير معاملات الحمض النووي ، تلعب خلايا تدفق الموائع الدقيقة دورا رئيسيا لأنها تسمح بالقياسات الخاضعة للرقابة على مستوى الجزيء الواحد بدقة مكانية وزمانية عالية (الشكل 2). يشير مصطلح الموائع الدقيقة إلى القدرة على معالجة السوائل في قناة واحدة أو أكثر بأبعاد تتراوح من 5-500 ميكرومتر10,11. يشير مصطلح التيار إلى السائل الفعلي داخل القناة وتشير القناة إلى القناة المادية التي يتحرك فيها تيار أو تيارات مائعة. يحتوي تصميم خلية التدفق أحادية القناة على قناة مادية مشتركة حيث يتم ملاحظة التفاعلات وعادة ما يكون هناك تيار سائل واحد فقط. وبالتالي ، تعرف هذه التصميمات باسم خلايا التدفق أحادية الدفق. في المقابل ، يتم تعريف خلايا التدفق متعددة الدفق على أنها جهاز موائع دقيقة تتلاقى فيه قناتان أو أكثر من قنوات الدخول في قناة مادية واحدة مشتركة (الشكل 2 أ). داخل القناة المشتركة ، تتدفق تيارات السوائل التي تنشأ من القنوات الفردية بالتوازي مع بعضها البعض ، وتظل منفصلة مع حدوث الحد الأدنى من الاختلاط بينها بسبب الانتشار (الشكل 2 ب). في معظم الإعدادات التجريبية ، تدفع مضخة واحدة السوائل إلى كل قناة بنفس السرعة. في المقابل ، عند استخدام التوجيه الحدودي ، تقوم ثلاث مضخات أو أكثر يتم التحكم فيها بشكل مستقل بدفع السوائل عبر القنوات. ومع ذلك ، تعمل كل مضخة بسرعة مختلفة ولكن معدل التدفق الصافي في القناة المشتركة ثابت12. هذا يسمح بالتبادل السريع لمكونات القناة الرئيسية ببساطة عن طريق تغيير سرعة المضخة.
بالإضافة إلى التدفق الصفحي ، هناك عامل حاسم آخر هو ملف تعريف سرعة القطع المكافئ داخل تيار السائل الرقائقي. تحدث أعلى سرعة تدفق في منتصف التيار ويحدث الأبطأ بجوار الأسطح (الشكل 2C)13. يجب اعتبار هذا المظهر الجانبي لتمديد جزيء الحمض النووي المرتبط بخرزة مثبتة في التيار بالكامل من أجل التصور الدقيق للحمض النووي الفلوري والتحليلات الدقيقة لجزيء واحد. هنا ، يمتد الحمض النووي إلى الشكل B ويتم تثبيته في مكانه تحت 0 pN من القوة. لتحقيق ذلك ، يجب أن يكون تركيز موضع المصيدة الضوئية على موضع 10-20 ميكرومتر من سطح الغطاء السفلي (الشكل 2D). يجب توخي الحذر حتى لا يمتد جزيء الحمض النووي إلى ما بعد الشكل B لأن هذا يمكن أن يمنع تفاعلات الإنزيم. في ظل ظروف المخزن المؤقت النموذجية ، 1 ميكرومتر = 3000 نقطة أساس من الحمض النووي14. علاوة على ذلك ، من خلال محاصرة 10-20 ميكرومتر من الغطاء ، يتم وضع مركب الحمض النووي بعيدا عن السطح وبالتالي تقليل التفاعلات السطحية.
تم استخدام العديد من الطرق لإنشاء قنوات جهاز الموائع الدقيقة ويمكن القيام بذلك في المختبر أو يمكن شراء خلايا التدفق من المصادر التجارية6،15،16،17. يجب أن تكون المواد المثلى المستخدمة لبناء خلايا التدفق صلبة ميكانيكيا ، وشفافة بصريا مع مضان منخفض ، وغير منفذة للمذيبات العضوية6. في كثير من الأحيان ، يتم استخدام الزجاج المصقول البورسليكات ، أو السيليكا المنصهرة لتوفير بيئة تدفق مستقرة لفترة طويلة مناسبة للاصطياد البصري والتصور واكتشاف القوة. تسمح هذه المواد أيضا باستخدام المذيبات غير المائية (على سبيل المثال ، الميثانول من الدرجة الطيفية) لتبسيط ترطيب السطح وإزالة فقاعات الهواء ، والمواد المسخة (على سبيل المثال ، 6M guanidinium hydrochloride) أو المنظفات لتنظيف خلية التدفق. أخيرا ، تختلف الطرق المستخدمة لإدخال السوائل في خلايا التدفق من أنظمة مضخات التفريغ المعقدة إلى مضخات المحاقن المفردة 14،18،19،20،21،22،23،24،25،26،27. في النهج الموضح هنا ، يتم استخدام مضخة حقنة يمكنها استيعاب ما يصل إلى 10 محاقن (الشكل 3 أ). يوفر هذا المرونة لاستخدام خلايا التدفق أحادية القناة أو خلايا التدفق ذات قنوات مدخل متعددة. هنا ، يتم استخدام خلية تدفق ثلاثية القنوات ويتم تزاوجها مع المحاقن المثبتة في مكانها على مضخة المحقنة باستخدام أنابيب poly-ether-ether-ketone (PEEK) (الشكل 3A-C). يتم التحكم في تدفق السوائل بواسطة صمامات تبديل رباعية الاتجاهات وبالتالي تعمل على تقليل إدخال الفقاعات في خلية التدفق (الشكل 3 أ ، د). بالإضافة إلى ذلك ، يوصى باستخدام محاقن هاملتون محكمة الغاز التي لها جدران زجاجية صلبة وغطاسات مطلية بالبولي تترافلوروإيثيلين (PTFE) ، لأنها توفر حركة مكبس سلسة بشكل استثنائي ضرورية للحصول على تدفق سلس14,27.
في النظام التجريبي الموصوف ، تم استخدام خلايا التدفق مع قناتين إلى خمس قنات. يتم تحديد عدد قنوات المدخل من خلال التجربة التي يتم إجراؤها. لدراسة RecBCD و Hop2-Mnd1 ، كانت قناتان دفق كافية14,28. بالنسبة إلى اللولب ، كان الإنزيم مرتبطا بالطرف الحر من الحمض النووي وترجم إلى تيار يحتوي على المغنيسيوم و ATP لبدء النقل والتفكيك. بالنسبة إلى Hop2-Mnd1 ، تمت ترجمة الحمض النووي المحاصر بصريا إلى تيار السائل المجاور الذي يحتوي على البروتينات والمخزن المؤقت ± أيونات المعادن ثنائية التكافؤ. يتيح استخدام خلايا التدفق ثلاثية القنوات للمرء حبس الحمض النووي في التيار 1 ، وترجمة الحمض النووي إلى التيار 2 للسماح بحدوث ارتباط البروتين ، ثم التدفق 3 حيث يوجد ATP ، على سبيل المثال ، لبدء التفاعلات. الاختلاف في ما سبق هو استخدام البروتين الموسوم بالفلورسنت في القناة 2 ، مما يؤدي إلى أن يكون تيار السائل أبيض تماما ويمنع تصور الحمض النووي. عندما يترجم هذا الجزيء إلى تيار 3 ، يكون كل من البروتينات والحمض النووي مرئيا الآن عند بدء التفاعلات.
يعد استخدام صمامات التبديل رباعية الاتجاهات للتحكم في تدفق السوائل مكونا مهما في النظام للقضاء على الفقاعات في خلايا التدفق. الفقاعات ضارة بتدفق السوائل المستقر لأنها تتقلص وتتوسع بطرق غير متوقعة مما يؤدي إلى تغيرات سريعة في سرعة التدفق وإدخال الاضطراب. عندما يتم وضع الصمامات بين المحاقن وأنابيب المدخل ، يتم فصل مسار التدفق عن طريق تبديل موضع الصمام عند تغيير المحاقن. عندما يتم وضع المحقنة الجديدة في مكانها ، يمكن الضغط على المكبس يدويا بحيث يتم إخراج >6 ميكرولتر (الحجم الميت للصمام) وهذا يزيل الفقاعات بالكامل تقريبا.
غالبا ما يكون ربط الموصلات بخلايا التدفق هو خطوة تحديد المعدل في استخدام خلايا التدفق. وصفنا استخدام نوعين من الموصلات: قابلة للإزالة تعرف باسم press-fit وأخرى دائمة (تجميعات nanoport). الموصلات القابلة للإزالة سهلة الالتصاق بخلية التدفق ويمكن اختبار أنواع مختلفة من الأنابيب المرنة بالإضافة إلى PTFE الموصى بها باستخدام هذه الموصلات. هذه طريقة سريعة وفعالة من حيث التكلفة لاختبار الأنابيب والموصلات دون التضحية بخلايا تدفق الزجاج الأكثر تكلفة. في المقابل ، يتم إرفاق مجموعات المنافذ النانوية بشكل دائم ، وتتحمل ضغوطا تصل إلى 1000 رطل / بوصة مربعة ، وفي أيدينا ، يقتصر استخدامها على أنابيب PEEK بأقطار مختلفة. هذا ليس عيبا حيث يفضل استخدام أنابيب PEEK. يمكن إعادة استخدام خلية تدفق زجاجية واحدة مع تجميعات دائمة مرفقة لأكثر من 1 سنة مع الاستخدام الدقيق.
Protocol
Representative Results
Discussion
يعد التجميع الدقيق لنظام التدفق أمرا بالغ الأهمية لنجاح نتائج التجارب 4,6. أحد أكثر جوانب البروتوكول تحديا هو ربط الموصلات بالسطح الزجاجي. لهذا ، نستخدم النهجين التاليين: موصلات الأنابيب المناسبة للضغط وتجميعات المنافذ النانوية. تلتصق الموصلات المناسبة لل?…
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يتم دعم البحث في مختبر بيانكو من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة GM100156 و GM144414 إلى PRB
Materials
| 100x objective | Leica | 506318 or 506038 | Oil immersion lenses; Imaging and optical trapping only; Plan APO objectives optimized for fluorescence imaging |
| 10X Objective | Leica | 506263 | Used to locate laser beams spots during alignment; to find focus and X-Y position in flow cell |
| 1 mm fluorescent beads | Bangs Labs | FSDG004 | Used for tap performance, focal position determination |
| 1 mm polystyrene beads | Bangs Labs | CPO1004 | Used for trap performance evaluation and binding to biotinylated molecules |
| 63x objective | Leica | 506081 | Used to locate laser beams spots during alignment and to find focus and X-y position in flow cell; can be used for optical trapping as it has an identical back aperture diameter to the 100X; oil immersion lens |
| Alignment laser | Lumentum | 1100 series | 10mW HeNe laser that is visible to the naked eye that is used to position optics |
| Beam alignment camera | Amscope | MU303 | A simple, inexpensive and software controlled camera for imaging of the beam position |
| Camera control and Image capture software | Hamamatsu | HCImage | Coordinates activities of the Lambda DG4 with the camera to facilitate rapid wavelength switching |
| Camera; Orca flash 4 | Hamamatsu | c13440-20cu | CCD camera for imaging of single-molecule experiments |
| C-mount for the beam alignment camera | Spot imaging solutions | DE50CMT | Provides optimal positioning of the camera for imaging of laser beams during alignment |
| C-mount for the Orca Flash 4 camera | Has a retainer ring to hold an IR blocking filter in place. This eliminates reflected IR beam from the optical traps and facilitates clearer imaging of trapped objects. | ||
| Cy5 fluorescence filter cube | Semrock | cy5-404a-lsc-zero | Used in conjunction with Lambda DG4 to image Cy5 only |
| Fitc-Txred fluorescence filter cube | Semrock | fitc/txred-2x-b-000 | Used in conjunction with Lambda DG4 to image FITC and TXRed |
| Fluidics tubing | Grace Bio | 46004 | PTFE tubing as an alternate to PEEK; works well on some flow cells. Can be used with PDMS flow cells or glass flow cells when Grace Bio fit tubing connectors are used |
| GFP fluorescence filter cube | Semrock | gfp-3035b-lsc-zero | Used in conjunction with Lambda DG4 to image GFP only |
| Glass flow cells | Translume | Custom | Clear flow channels for imaging (Fig. 2E) |
| Glass glue | Loctite | 233841 | Securely and easily bonds Nanoport assemblies to glass flow cells |
| Glass/PDMS sandwich flow cells | CIDRA Precision services | Custom design | Flow cells built according to your specifications; imaging channels are clear (Fig. 2C) |
| Hamilton Cleaning solution | Hamilton | 18311 | Gentle but efficient cleaning solution for glass flow cells; does not bubble when used carefully |
| Illumination system | Sutter Instrument | Lamda DG4 | Discontinued so recommend Lambda 721 |
| Illumination system | Sutter Instrument | Lamda DG4 | Discontinued so recommend Lambda 721 |
| Image analysis software | Media cybernetics | Image Pro Premiere | Analysis of images and single molecule tracking |
| Image analysis software | Fiji/NIH Image/Image J | Shareware | Analysis of images and single molecule tracking |
| Image display card | Melles Griot | 06 DLA 001 | Alternate product from Thorlabs: VRC5 |
| Immersion oil | Zeiss | 444960 | Immersol 518 F fluorescence free |
| Laser beam alignment tools | Thor labs | FMP05/M; dgo5-1500-h1; BHM1 | Used to ensure beams are horizontal and at the correct height |
| Laser beam viewer | Canadian Photonics labs | IR 3150 | Used to image IR beam spots on mirrors and targets |
| Laser power meter | Thor labs | Measurement of laser output as well as trap strength | |
| Laser safety glasses (HeNe) | Thor labs | LG7 or 8 | Blocks >3 OD units of light of wavelengths >600 nm |
| Laser safety glasses (IR) | Thor labs | LG11 | Blocks >7 OD units of light of wavelengths ³1000 nm |
| Mcherry fluorescence filter cube | Semrock | mcherry-a-lsc-zero | Used in conjunction with Lambda DG4 to image mcherry only |
| Microscope | Leica | DMIRE2 | DIC port removed to accommodate Dichroic trapping/alignment mirror |
| Microscope control software | UCSF/shareware | uManager | Controls the microscope, permits focal alignment of objectives as well as stage control |
| Nanoport assembly | IDEX | N333 | Connectors that are bonded to flow cells |
| Optical table support | Thor Labs | PA52502 | Active isolation table support |
| Optics and lenses | Solar TII | Various | Interference mirrors, telescopes and lenses custom designed for the system |
| PDMS flow cells | ufluidix | Custom | Flow cells built according to your specifications; imaging channels are clear (Figs. 2B and D) |
| PEEK tubing | IDEX | 1532 | Provides excellent connection to flow cells and switching valves |
| Pinkel fluorescence filter cube | Semrock | lf488/543/635-3x-a-000 | Used in conjunction with Lambda DG4 to image multiple fluorophores rapidly |
| Press fit tubing connectors | GraceBio | 46003 | Clear silicone connector with adhesive that binds well to glass |
| Scanning mirrors | GSI Lumonics | VM500 | Used to provide control of the second optical trap. GSI Lumonics no longer exists. Similar mirrors can be purchased from Cambridge Scientific |
| Stage | Leica | ||
| Stage micrometer | Electron Microscopy Sciences | 68042-08 | Provides on screen ruler for positioning of the beam and system calibration |
| Switching valves | IDEX | V-101T | Control direction of fluid flow and eliminate introduction of bubbles into flow cells |
| Syringe and valve manifold | Machine shop | None | Custom built |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | PHD 2000 | Controls fluid flow through flow cells |
| Syringe pump software | Harvard Apparatus | 70-6000 | Flow control provides seamless, programmable control of fluid flow |
| Syringes | Hamilton | 81320 | Gas-tight, PTFE Luer Lock, glass barrels with Teflon-coated plungers |
| Table top | Thor Labs | T36H | Optical table top or breadboard |
| Trapping laser | Newport/Spectra Physics | J-series; BL106C | Nd:YAG laser; 1064 nm; 5W laser |
Referanslar
- Bianco, P. R., Lu, Y. Single-molecule insight into stalled replication fork rescue in Escherichia coli. Nucleic Acids Research. 49 (8), 4220-4238 (2021).
- Kaur, G., Lewis, J. S., van Oijen, A. M. Shining a spotlight on DNA: Single-molecule methods to visualise DNA. Molecules. 24 (3), 491 (2019).
- Dame, R. T., Noom, M. C., Wuite, G. J. Bacterial chromatin organization by H-NS protein unravelled using dual DNA manipulation. Nature. 444 (7117), 387-390 (2006).
- Bianco, P. R., Bradfield, J. J., Castanza, L. R., Donnelly, A. N. Rad54 oligomers translocate and cross-bridge double-stranded DNA to stimulate synapsis. Journal of Molecular Biology. 374 (3), 618-640 (2007).
- Amitani, I., Liu, B., Dombrowski, C. C., Baskin, R. J., Kowalczykowski, S. C. Watching individual proteins acting on single molecules of DNA. Methods in Enzymology. 472, 261-291 (2010).
- Brewer, L. R., Bianco, P. R. Laminar flow cells for single-molecule studies of DNA-protein interactions. Nature Methods. 5 (6), 517-525 (2008).
- Visscher, K., Brakenhoff, G. J., Krol, J. J. Micromanipulation by multiple optical traps created by a single fast scanning trap integrated with the bilateral Confocal scanning laser microscope. Cytometry. 14, 105-114 (1993).
- Vermeulen, K. C., Mameren, J. v. Calibrating bead displacements in optical tweezers using acousto-optic deflectors. Review of Scientific Instruments. 77 (1), 013704 (2006).
- Dufresne, E. R. Computer-generated holographic optical tweezers arrays. Review of Scientific Instruments. 72 (3), 1810 (2001).
- Squires, T. M., Quake, S. R. Microfluidics: fluid physics at the nanoliter scale. Reviews of Modern Physics. 77, 977-1026 (2005).
- Weibel, D. B., Whitesides, G. M. Applications of microfluidics in chemical biology. Current Opinion in Chemical Biology. 10 (6), 584-591 (2006).
- Tan, X., Mizuuchi, M., Mizuuchi, K. DNA transposition target immunity and the determinants of the MuB distribution patterns on DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (35), 13925-13929 (2007).
- Lima, R., Wada, S., Takeda, M., Tsubota, K., Yamaguchi, T. In vitro confocal micro-PIV measurements of blood flow in a square microchannel: the effect of the haematocrit on instantaneous velocity profiles. Journal of Biomechanics. 40 (12), 2752-2757 (2007).
- Bianco, P. R., et al. Processive translocation and DNA unwinding by individual RecBCD enzyme molecules. Nature. 409 (6818), 374-378 (2001).
- Forget, A. L., Dombrowski, C. C., Amitani, I., Kowalczykowski, S. C. Exploring protein-DNA interactions in 3D using in situ construction, manipulation and visualization of individual DNA dumbbells with optical traps, microfluidics and fluorescence microscopy. Nature Protocol. 8 (3), 525-538 (2013).
- Streets, A. M., Huang, Y. Microfluidics for biological measurements with single-molecule resolution. Current Opinion in Biotechnology. 25, 69-77 (2014).
- Madariaga-Marcos, J., Corti, R., Hormeno, S., Moreno-Herrero, F. Characterizing microfluidic approaches for a fast and efficient reagent exchange in single-molecule studies. Scientific Reports. 10 (1), 18069 (2020).
- Grayson, P., Han, L., Winther, T., Phillips, R. Real-time observations of single bacteriophage lambda DNA ejections in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (37), 14652-14657 (2007).
- Luo, G., Wang, M., Konigsberg, W. H., Xie, X. S. Single-molecule and ensemble fluorescence assays for a functionally important conformational change in T7 DNA polymerase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (31), 12610-12615 (2007).
- Sia, S. K., Whitesides, G. M. Microfluidic devices fabricated in poly(dimethylsiloxane) for biological studies. Electrophoresis. 24 (21), 3563-3576 (2003).
- Wuite, G. J. L., Davenport, R. J., Rappaport, A., Bustamante, C. An integrated laser trap/flow control video microscope for the study of single biomolecules. Biophysical Journal. 79 (2), 1155-1167 (2000).
- Kim, S., Blainey, P. C., Schroeder, C. M., Xie, X. S. Multiplexed single-molecule assay for enzymatic activity on flow-stretched DNA. Nature Methods. 4 (5), 397-399 (2007).
- Tanaka, H., Ishijima, A., Honda, M., Saito, K., Yanagida, T. Orientation dependence of displacements by a single one-headed myosin relative to the actin filament. Biophysical Journal. 75 (4), 1886-1894 (1998).
- Merenda, F., Andrews, D. L., Galves, E. J., Nienhuis, G., et al. Refractive multiple optical tweezers for parallel biochemical analysis in micro-fluidics. Proceeding of SPIE. , 6483 (2007).
- Brewer, L. R., Corzett, M., Balhorn, R. Protamine-induced condensation and decondensation of the same DNA molecule. Science. 286 (5437), 120-123 (1999).
- Ladoux, B., Quivy, J. P., Doyle, P. S., Almouzni, G., Viovy, J. L. Direct imaging of single-molecules: from dynamics of a single DNA chain to the study of complex DNA-protein interactions. Science Progress. 84, 267-290 (2001).
- Bianco, P. R., Bradfield, J. J., Castanza, L. R., Donnelly, A. N. Rad54 oligomers translocate and cross-bridge double-stranded DNA to stimulate synapsis. Journal of Molecular Biology. 374 (3), 618-640 (2007).
- Pezza, R. J., Camerini-Otero, R. D., Bianco, P. R. Hop2-Mnd1 condenses DNA to stimulate the synapsis phase of DNA strand exchange. Biophysical Journal. 99 (11), 3763-3772 (2010).
- Rye, H. S., et al. Stable fluorescent complexes of double-stranded DNA with bis-intercalating asymmetric cyanine dyes: properties and applications. Nucleic Acids Research. 20 (11), 2803-2812 (1992).
