미세 소관 선인장체의 자체 조립
Özet
이 기사는 MAP65, 식물 기반 미세 소관 가교제 및 PEG를 크라우밍 제로 사용하여 촉각제 모양의 미세 소관 어셈블리를 형성하기위한 프로토콜을 제시합니다.
Abstract
세포 골격은 세포 내에서 주요 내부 조직 및 재구성을 담당하며, 모두 변화를 지시 할 관리자없이 이루어집니다. 이것은 특히 유사분열 또는 meiosis 동안 미세 소관이 세포 분열 중에 스핀들을 형성하는 경우입니다. 스핀들은 세포 분열 중에 유전 물질을 분리하는 데 사용되는 기계입니다. 시험관 내에서 자체 조직 된 스핀들을 만들기 위해 우리는 최근에 미세 소관 관련 단백질 및 군중 제제의 최소 세트로 스핀들 모양의 어셈블리로 미세 소관을 재구성하는 기술을 개발했습니다. 구체적으로, MAP65가 사용되었는데, 이는 식물로부터의 항평행 미세소관 가교결합제이며, 효모로부터의 Ase1 및 포유동물 유기체로부터의 PRC1의 상동체이다. 이 가교제는 미세 소관을 길고 얇고 스핀들과 같은 미세 소관 자체 조직 어셈블리로 자체 조직화합니다. 이 어셈블리는 또한 액정 촉각과 유사하며, 미세 소관은 메조 스케일 메조겐으로 사용될 수 있습니다. 여기에서는 이러한 미세 소관 촉각을 만들 뿐만 아니라 형광 현미경을 사용하여 어셈블리의 모양을 특성화하고 광표백 후 형광 회수를 사용하여 구성 요소의 이동성을 특성화하기 위한 프로토콜이 제시됩니다.
Introduction
유사분열을 통한 세포 분열은 생명을 유지하는 가장 중요한 생물학적 과정 중 하나입니다. 튜불린 이량체로 구성된 미세 소관 필라멘트는이 과정의 필수 구조 요소입니다. 염색체가 세포 중심에서 정렬될 때 메타페이즈에서 생성된 과도 기계류는 실로 덮인 직조기의 스핀들과 같은 모양 때문에 유사분열 스핀들이라고 불립니다(그림 1A). 많은 유기체에 걸쳐 미세 소관이 메타 페이즈에서 응축 된 염색체를 세포의 중심으로 밀어 넣고 당겨서 정렬하고 아나 페이즈에서 분리되는 미세 소관에 연결하는 데 사용된다는 것은 잘 알려져 있습니다 (그림 1B, C). 스핀들은 meiosis (그림 1B)와 유사 분열 (그림 1C) 모두에서 형성되며, 스레드처럼 중심축을 감싸지 않고 인터페이스와 평행하게 실행되는 많은 겹치는 미세 소관에서 생성됩니다. 이러한 미세 소관 기반 구조를 만들려면 가교 결합 된 관련 단백질과 염색체1을 밀고 당기는 데 도움이되는 모터 역할을 할 수있는 관련 효소가 필요합니다.
meiotic spindles 에 대한 연구에 따르면 미세 소관은 짧고 동적이며 가교 된 배열 2,3,4,5,6 에서 겹치는 것으로 나타났습니다 (그림 1Di). 이러한 짧은 미세 소관의 물리적 조직으로 인해 meiotic 스핀들은 액정 선탠토이드와 유사합니다 (그림 1E). 실제로, 스핀들은 액정 촉각제5에서 기대할 수 있듯이 합체되고 병합되는 것으로 나타났습니다.
1960 년대로 거슬러 올라가는 많은 연구에서는 고정, 직렬 섹션 및 전자 현미경을 사용하여 유사 분열 스핀들 7,8,9,10 내부에 두 가지 유형의 미세 소관이 있음을 확인했습니다. 첫 번째 유형은 스핀들 극을 키네토코레에 연결하는 kinetochore microtubules라고합니다. 두 번째 유형은 염색체를 지나서 자라며 중간 영역에서 겹치는 극간 또는 극성 미세 소관이라고합니다 (그림 1Dii) 8,9,10. 세 번째 유형은 스핀들 외부에 있고 극을 세포 가장자리에 연결하는 아스트랄 미세 소관이라고합니다. 이러한 미세 소관 조직은 현재 논의의 범위를 벗어납니다. 오그민6과 감마-튜불린 고리 복합체 사이의 상호작용에 대한 최근의 연구가 미세소관의 핵형성 중심에 영향을 미치며, 그 결과 도 1D와 같이 더 짧은 미세소관을 갖는 유사분열 스핀들을 초래한다.
미세 소관은 넓은 것보다 길기 때문에 높은 종횡비와 높은 강성을 가지고 있기 때문에 액정 분자의 확장 된 버전과 같습니다. 연질 물질 물리학에서, 원자와 분자는 핵형성 및 결정(11)의 용융을 포함하는 상전이의 물리적 메카니즘을 추론하기 위해 최소한의 상호작용을 사용하여 근사화되었다. 마찬가지로, 미세 소관은 액정 분자의 확장 된 버전 인 중규모 객체로, 등방성 물질로부터 네마틱 상들의 핵화 및 성장을 포함하여 액정 역학의 물리학에 대한 통찰력을 제공합니다. 또한, 상기 논의된 바와 같이, 마이오틱 스핀들은 액정 분자 3,4,5의 등방성 상태로부터 핵을 형성하고 성장하는 네마틱 상태인 액정 촉각의 것과 같은 특성을 나타낸다. 촉각의 경우, 핵형성 및 성장은 다른 결정의 핵과 같다(즉, 비교적 높은 농도의 메조겐[액정을 형성하는 분자]를 필요로 함). 선인장의 독특한 “스핀들” 모양은 네마틱 상에 정렬되는 액정 메조겐의 국부적 정렬에서 비롯됩니다(그림 1E). 분자가 매우 비대칭적이기 때문에 둥근 결정을 형성 할 수 없습니다. 미세 소관의 특성을 감안할 때, 미세 소관의 높은 국소 농도로 만들어진 유사 분열 스핀들 – 기계가 선인장 또는 스핀들이라고하는 것과 같은 모양이라는 것은 놀라운 일이 아닙니다. Tactoids는 양극성일 수 있으며, 극은 테이퍼 끝(그림 1Ei)에 있거나 균질할 수 있으며, 극은 무한대에서 효과적으로 나타납니다(그림 1Eii).
스핀들 형성의 중요성을 감안할 때, 이온성 종 12,13, 고갈 상호작용을 생성하는 크라우드 제제 14,15, 및 특정 미세 소관가교 단백질 13,16,17,18,19를 통해 다발로 미세소관 축합을 시연함으로써 시험관 내에서 자체 조직화된 스핀들 형성을 향한 노력이 진행되고 있으며, 21. 놀랍게도,이 약제는 모두 미세 소관의 국소 농도를 증가시키기 위해 노력하지만, 종종 긴 미세 소관 다발을 초래하지만 촉각제는 아닙니다. 이러한 번들이 긴 한 가지 이유는 그들을 구성하는 미세 소관도 길기 때문일 수 있습니다. 더 짧은 미세 소관을 사용한 최근의 연구는 또한 끝15에서 테이퍼되지 않는 더 긴 번들을보고했다. 이 경우, 번들은 번들의 확장을 일으키는 모터 단백질과 함께 유지되어 더 길어집니다. 비인장 가교결합제를 갖는 짧은 미세세관은 여기에 설명된 바와 같이 테이퍼링된 스핀들형 어셈블리에 필요하다.
최근에, 우리는 핵을 형성하는 안정한 미세소관(22)의 존재 하에, 항평행 가교결합제인 MAP65를 사용하여 미세소관 촉각의 생성을 가능하게 하는 기술을 개발하였다. 미세소관은 짧을 필요가 있었지만, 미세소관 길이의 알려진 조절제는 거의 없으며, 미세소관은 동적 불안정성 또는 종단간 어닐링에 대항하여 미세소관을 캡핑할 수 있다. 대신, GMPCPP는 성장 후 필라멘트를 핵으로 만들고 안정화시키기 위해 사용되었다. 이것은 촉각으로 자체 조직 할 수있는 짧은 미세 소관의 고밀도를 만들 수있었습니다. 이들 촉각제는 복굴절 하에서 볼 때 동질적이었다. 짧은 미세소관 이외에, 특정 항평행 가교결합제인 MAP65가 촉각을 형성하기 위해 사용되었다(도 2). MAP65는 유사분열성 가교결합제(23)의 PRC1/Ase1 패밀리 내의 식물 미세소관-관련 단백질이다. MAP65는 이량체로서 존재하며, 미세소관(24)뿐만 아니라 그 자체에 결합하는 강한 친화력을 갖는다. 양극성이고 액정의 액체 유사 특성을 갖는 액틴 필라멘트 25,26,27 로 관찰된 마이오틱 스핀들 및 촉각과는 달리, 미세소관 촉각은 고체형22,28인 것으로 관찰되었다.
여기에서는 미세 소관 촉각을 만들고 형광 기반 기술을 사용하여 어셈블리의 모양과 구성 요소의 이동성을 특성화하기위한 프로토콜이 제시됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 설명 된 방법은 미세 소관 촉각을 만들기 위해 여러 논문에서 사용되었습니다 (그림 2) 22,28. 이러한 실험은 대부분의 세포 유형에서 유사분열 또는 마이오틱 스핀들의 형태와 안정성을 조절하는 조직 원리를 밝히는 데 도움이 되는 생물학적으로 관련이 있다. 또한, 미세 소관은 액정이 등방성 상으로부터 핵을 형성하고 네마틱 상을 성장시키는 방법에 대해 더 많이 배우는 데 도움이되는 모델 액정 메조겐입니다.
여기에 설명 된 절차는 미세 소관 자체 조직을 탐구하기위한 몇 가지 장점이 있습니다. 첫째, 실험실에서 시작하기 전에 예지력이나 훈련이 거의없는 고등학생을 포함한 많은 학생들이 실험실에서 수행 한 것으로 재현 가능성이 높습니다. 촉각은 복굴절성(birefringent)(22)으로, 형광 현미경 검사 이외에 투과광에서 볼 수 있게 되어, 이 방법을 많은 실험실에서 이용할 수 있게 하고, 이 실험 절차는 하이엔드 연구 외에도 교육 목적에 적응할 수 있다. 마지막으로,이 과정은 제거 된 환원 주의적 접근 방식으로 생물학적 시스템을 계속 이해하고 조사 할 수있는 길을 열어 각 추가 조건, 단백질 또는 첨가제가 촉각제의 자체 조직을 어떻게 바꿀 수 있는지, 그리고 궁극적으로 스핀들을 어떻게 바꿀 수 있는지 이해할 수있게합니다. 더 나은 생체모방을 위한 표적은 활성, 유동성 및 필라멘트 극성 분류를 포함한다.
예기치 않은 결과를 제공하는 실험에 영향을 미치는 몇 가지 요인이있을 수 있습니다. 예를 들어, 촉각이 형성되지 않지만(그림 2) 팬형 패턴이 관찰되는 경우, MAP65는 미세소관(22,28)에 존재하지 않거나 결합하지 않을 가능성이 높다. 이것은 GFP-MAP65가 미세소관에 결합하지 않기 때문에 MAP65 형광 채널에서도 명백해야합니다.
촉각이 형성되지 않고 배경이 유리에 얼룩으로 나타나면 표면 코팅 때문일 수 있습니다. 일단 수행되면, 실란화는 커버 슬립에서 1 개월 만 지속됩니다. 그것이 마모 될 때, 튜불린은 노출 된 표면에 비특이적으로 결합 할 수있을 것입니다. 이 바인딩은 이상한 패턴에서 발생합니다.
촉각이 형성되지 않고 튜불린이 다양한 모양과 크기의 응집체에서 관찰된다면, 이것은 품질이 좋지 않은 튜불린 때문일 수 있습니다. 투불린은 미세소관 중합 대신에 이러한 오프 경로 응집을 구동할 수 있는 초기 응집체를 제거하기 위해 원심분리될 수 있다. 표면이 튜불린에 결합하면 용액의 튜불린을 고갈시킬 수도 있습니다. 미세 소관을 중합하는 데 중요한 농도보다 낮은 농도의 튜불린은 응집체를 초래할 수 있습니다.
FRAP 실험에서, MAP65 채널이 어떠한 회복도 나타내지 않으면(도 5), 광표백이 미세소관을 광손상시켰을 가능성이 있다. 광손상은 필라멘트의 국부적 인 파괴를 일으 킵니다. 이것은 전송 된 채널에서 검사에 의해 확인 될 수있다. 미세소관 촉각은 주변 물과의 높은 굴절률 불일치를 통해 투과된 채널에서 볼 수 있다. 광-유도된 광손상은 광표백을 실시한 ROI의 위치에서 투과된 광 이미징에서 화상 마크 또는 콘트라스트 손실로 나타날 것이다. 이런 일이 발생하면 단백질의 광손상을 억제하기 위해 레이저 또는 광력을 줄여야합니다.
이 절차와 접근 방식에서 몇 가지 문제가 발생했습니다. 한 가지 문제는 길이 측정이 현재 이미지를 클릭하여 손으로 수행된다는 것입니다. 이 방법은 간단하지만 불확실성이 높아질 수 있습니다. 횡단면과 가우시안에 피팅을 사용하는 폭 측정은 크기를 정량화하는 더 좋은 방법입니다. 길이에 대해서도 비슷한 방법을 사용할 수 있습니다. 두 번째 문제는 때로는 촉각제가 너무 길고 얇기 때문에 구부러질 수 있다는 것입니다. 이로 인해 길이를 정량화하는 것이 더 어려워집니다. 윤곽선 길이는 세그먼트 선을 사용하여 정량화 할 수 있지만 세그먼트가 추가 될 때마다 불확실성이 추가됩니다.
과학적 관점에서 볼 때,이 접근법은 액정 또는 스핀들의 모델로 사용하기위한 몇 가지 다른 과제를 가지고 있습니다. 첫 번째 과제는 미세 소관이 만드는 촉각의 길고 얇은 모양이었습니다 (그림 3 및 그림 4). 이전 간행물22에서 언급된 바와 같이, 미세소관 촉각제는 양극성이 아닌 균질한 촉각이다. 이것은 모양을 구성하는 미세 소관이 구조의 끝을 가리키도록 방향을 바꾸지 않는다는 것을 의미합니다. 대신, 모든 미세 소관은 장축에 평행하고 “극”은 무한대에 위치합니다. 이것은 분자 액체 결정 또는 액정 메조겐으로도 작용할 수있는 액틴 또는 DNA에 대해 관찰 된 촉각제와 매우 다릅니다. 이러한 다른 시스템에서, 촉각제는 양극성이며, 교차 편광자에서 볼 때, 그들은 막대의 재방향의 명백한 징후를 보여줍니다.
이 시스템의 두 번째 주요 과제는 미세 소관이 촉각 내부에서 움직이지 않는다는 것입니다. 이것은 미세소관의 회수율이 매우 낮기 때문에 FRAP 실험 및 분석으로부터 명백하다. 그들의 고체와 같은 성질은 미세 소관 촉각을 대규모 액정 유사체로서 덜 가치있게 만듭니다. 액정의 네마틱 상은 액체 (유체) 및 결정 (조직화) 특성을 모두 가져야합니다. 모양이 스핀들에 적합한 것처럼 보이지만, 부동성으로 인해 시스템은 모델 유사 분열 스핀들로서 덜 흥미 진진합니다. 반면에이 문제는 시스템에서 더 많은 유동성을 창출하기 위해 실험을 수정하는 방법을 조사 할 수있는 기회를 제공합니다.
이러한 과학적 도전은 시스템에 대한 새로운 지식을 허용하는 흥미로운 기회를 제공합니다. 미세 소관 촉각을 더 양극성으로 만들기 위해, 하나는 더 짧은 미세 소관을 사용할 수 있습니다. 그러나 미세 소관에는 액틴처럼 길이를 조절하는 잘 특성화 된 캡핑 단백질이 많지 않기 때문에 추가적인 도전이 있습니다. 핵형성과 성장의 사용은 짧은 미세 소관을 만들기 위해 매우 높은 농도의 튜불린과 GMPCPP를 사용해야합니다. 높은 튜불린 농도는 시스템에 더 많은 수의 필라멘트를 초래하여 타크토이드를 서로 분리하기가 더 어려워집니다. DARPin33과 같은 새로운 미세 소관 캐퍼의 추가는이 상황에 도움이 될 수 있습니다. 움직이지 않는 미세 소관의 두 번째 문제는 유사 분열에 사용되는 모터의 사량체 인 kinesin-534와 같은 운동 단백질의 첨가에 의해 완화 될 수 있습니다. 대안적으로, 이량체 키네신-1의 인공 이량체(15)가 사용될 수 있다.
더 많은 유동성을 추가하는 또 다른 방법은 미세 소관이 동적 불안정, 미세 소관의 성장 및 수축을 수행 할 수있게하는 것입니다. 현재, 안정한 GMPCPP 필라멘트로 시드되고 동적 불안정을 겪는 미세 소관은 스핀들 또는 촉각을 형성하기 위해 원하는 것보다 훨씬 길며, 이는 팬이나 번들과 같은 매우 긴 조직을 초래할 것입니다. 따라서 미세 소관 동적 불안정성을 추가하는 것은 선인장 모양을 보존하기 위해 신중하게 수행되어야합니다. 길이를 조절할 수 있는 관련 단백질 및 효소의 첨가는 이러한 문제를 완화시킬 수 있다. 예를 들어, kinesin-1335와 같은 탈중합 키네신이나 katanin36과 같은 효소를 절단하는 것이 필요할 수 있습니다. 이 실험은 복잡하고 어렵지만 결과가 밝혀 지더라도 매우 통찰력이 있습니다. 미래의 실험이 어떤 방향으로 나아가든, 미세 소관 촉각을 만들기 위해 여기에서 개발 된 플랫폼은 미세 소관 조직의 물리적 기초에 새로운 정보를 노출 할 수 있습니다.
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 2021 년 여름 Ross Lab 회원, 특히 K. Alice Lindsay의 도움에 감사드립니다. 이 작업은 NSF BIO-2134215의 보조금으로 S. Sahu, N. Goodbee, H.B. Lee 및 J.L. Ross를 지원했습니다. KECK 재단 (Rae Anderson, USD, lead PI)의 보조금은 R. Branch와 P. Chauhan을 부분적으로 지원했습니다.
Materials
| 2% Dichlorodimethylsilane | GE Healthcare | 118945 | A hydrophobic silane surface treatment. This can be resused upto three times and kept at room temperature for one year. |
| 5-minute epoxy | Bob Smith Industries | For sealing experimental chambers | |
| Acetone | Fisher | 32900HPLC | 100% |
| BL21 cells | Bio Labs | C2527I | Competent bacterial cells used to express MAP65 |
| Catalase | Sigma | C30-500MG | Part of the oxygen scavenging system. A 300 mg/ml stock is made in ddH2O and stored in 10 μl aliquots in -20°C for upto one year. |
| Coverslips (22 mm x 22 mm or 22 mm x 30 mm) | Fisher | 12544-AP | For experimental chambers |
| Dithiothreitol | Sigma | 43815-5G | A small molecule that is used to break disulfide bonds and scavenge oxygen. A 1 M stock is made from powder (Sigma) in ddH2O. The solution is aliquoted and stored at -20C for upto one year. The aliquots are used 7-8 times then discarded. |
| EGTA | Sigma | E3889-10G | Tubulin buffer base ingredient |
| Eppendorf 0.5 ml tubes | Eppendorf | 05 402 18 | For holding experimental solutions |
| Ethanol | Fisher | 111000200 | 200 proof |
| Filter paper | Whatman | 1004-110 | For cleaning and for pulling solutions through experimental chambers |
| Fluorescence microscope with high NA objectives | Nikon | Ti-E, W2 Confocal | For imaging experiments |
| Freezer -20°C | Fisherbrand | 13986148 | For storing reagents |
| Freezer -80°C | Thermo scientific | 328223H01-C | For storing proteins. |
| Glass containers for silanization | Michaels | For preparing experimental chambers – treating cover glasses | |
| Glass slides | Fisher | 12544-4 | For experimental chambers |
| Glucose | Sigma | G7528-250G | Part of the oxygen scavenging system. A 300 mg/ml stock is made in ddH2O and stored in 10 μl aliquots in -20°C. |
| Glucose oxidase | Sigma | G2133-250KU | Part of the oxygen scavenging system. This is stored at 4°C for upto one year. |
| GMPCPP | Jenna Bioscience | NU-4055 | Slowly hydrolyzable analog of GTP used to polymerize and stabilize the microtubules by reducing the dynamic instability and spontaneous critical concentration for microtubule nucleation to get a consistent length. We purchase a 10 mM stock from Jena Biosciences and store it at -20°C for upto one year. |
| Heating element for microscope | Okolab stage top incubator | For imaging experiments | |
| Imidizole | Sigma | I2399 | Used to elute MAP65 protein from Nickel beads to purify MAP65 |
| Kimwipes | Fisher | 34155 | For cleaning and for pulling solutions through experimental chambers. |
| KOH | Sigma | P250-500 | 1 M in ddH2O, made fresh to prevent acidification over time. |
| Liquid Nitrogen | Airgas | NI 230LT22 | To drop freeze aliquots. This can also be used for storage (not recommended) |
| MAP65 protein | Ram Dixit | A microtubule-associated protein (MAP) with a molecular weight of 65 kD that is an antiparallel microtubule crosslinker. We have purified an unlabeled and GFP-labeled version of MAP65-1 from Arabidopsis thaliana. We mix the GFP-MAP65 with the unlabeled MAP65 such that 10% of the protein is labeled. The working stock is a 10.8 μM solution. This working solution is stored at 4°C and remade fresh every week. The protocol for purifying the MAP65 and GFP-MAP65 is given in our prior methods chapter (26). | |
| MgSO4 | Sigma | MKCJ940 | Tubulin buffer ingredient |
| NTA-Nickel beads | Qiagen | 30210 | Beads required to purify 6xHis tagged MAP65 proteins |
| Optomicroscan | Nikon | 405 nm laser system which can focus the laser in any desired shape of region of interest | |
| PEM80 | Neutral tubulin polymerizing base buffer for solution made from 80 mM K-PIPES, pH 6.8, 1 mM MgSO4, 1 mM EGTA, stored at 4°C for upto one year. | ||
| Permanent double-sided tape | 3M – Scotch | 34-8724-5691-7 | For experimental chambers |
| Petri dish | Fisher | FB0875713 | For humid chamber |
| PIPES | Sigma | P7643-100G | Tubulin buffer base ingredient |
| Pluronic-F127 | Sigma | P2443-250G | A block-copolymer with two hydrophilic polyethylene oxide (PEO) blocks on the ends and a hydrophobic center block of polyphenylene oxide (PPO) hydrophobic surface coating we use to prevent protein binding to the surface. Pluronic-F127 is purchased as a powder (Sigma) and dissolved to a 5% (w/v) solution in ddH2O overnight. Once dissolved, the solution can be stored at room temperature for upto one year. |
| Polyethylene Glycol | Affymetrix Inc | 19966 500 GM | A crowding agent used to create depletion forces to bring tactoids to the surface and help to organize microtubules. We create a 5% (w/v) solution of 100 kDa PEG in PEM80. The solution is stored in 4°C for upto one year and placed on the rocker before use. It is viscous, so we recommend using a positive displacement pipette to work with it. |
| Positive displacement pipette | Eppendorf | For pipetting viscous liquids | |
| Racks for coverslips | Electron Microscopy Sciences | 72240 | For preparing experimental chambers – treating cover glasses |
| Refrigerator 4°C | Fisherbrand | For storing reagents | |
| Tubulin Labeled | Cytoskeleton | TL590M | lyophilized rhodamine-labeled tubulin from pig brain is purchased (Cytoskeleton) and stored in -80°C until hydrated in PEM80 and used for upto one year. |
| Tubulin protein | Cytoskeleton | T240 | lyophilized tubulin 99% pure unlabeled from pig brain is purchased (Cytoskeleton) and stored in -80°C until hydrated in PEM80 and used for upto one year. |
| UV-Ozone | Jelight | Model 342 | For preparing experimental chambers – treating cover glasses |
| Stackreg | Biomedical Imaging Group | http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/ | plugin for registering time series data to remove drift |
| Turboreg | Biomedical Imaging Group | http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/ | plugin for registering time series data to remove drift |
Referanslar
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