微管触觉的自组装

注意：除非另有说明，否则实验的某些部分可以在实验室工作台上进行，同时穿着适当的防护设备（手套）。 1. 盖玻片硅烷化 注意：盖玻片必须经过硅烷化处理，才能与这些实验中使用的聚合物刷涂层一起使用。这是一种疏水性硅烷化处理，允许具有疏水性中心嵌段的嵌段共聚物结合并形成聚合物刷。应在通风橱中执行以下步骤，以防止戴手套时接触有毒蒸气。二甲基二氯硅烷具有剧毒，必须非常小心地处理。 按顺序用ddH2O，70%乙醇和ddH2O冲洗盖玻片。每次冲洗之间用不起毛的实验室湿巾擦干它们。这在处理前从表面去除灰尘和水溶性或有机颗粒。 将盖玻片放入金属盖玻片夹持架中，并将盖玻片转移到紫外线臭氧（UVO）机器上。用UVO照射盖玻片20分钟以除去任何背景荧光。可以使用等离子体室代替 UVO。 使用镊子，将盖玻片从用于UVO处理的金属架转移到用于硅烷化的其他金属架上。不要对两者使用相同的机架，因为当应用UVO时，它会导致高水平的氧化。用水和乙醇对机架进行预清洁，以免残留先前使用的化学品。 将装有盖玻片的架子浸入装有100%丙酮的容器中1小时。用自来水冲洗容器3x，然后用ddH2O冲洗3x以除去所有丙酮。 用盖玻片将架子浸入100%乙醇中10分钟。用自来水冲洗容器3x，然后用ddH2O冲洗3x以除去所有乙醇。 用盖玻片将机架浸入ddH 2 O中3x，每次5分钟。 将装有盖玻片的培养架浸入 0.1 M KOH（50 mL 1 M KOH，450 mL ddH2O）中 15 分钟。用自来水冲洗容器3倍，然后用ddH2O冲洗3倍以除去所有KOH。 用盖玻片将机架浸入ddH 2 O中3x，每次5分钟。 用盖玻片将机架在通风橱或层流通风橱中风干过夜。 完全干燥架子和盖玻片后，将它们浸入2%二甲基二氯硅（DDS）中5分钟，该容器取于专门用于硅烷的不同容器中。不要让任何不干燥的东西与硅烷接触。 将架子和盖玻片浸入装有100%乙醇的容器中2×5分钟。用自来水冲洗容器3倍，然后用ddH2O冲洗3倍。 将机架和盖玻片浸入ddH2O中3x，每次5分钟。 用盖玻片将机架在通风橱或层流通风橱中风干过夜。 在最后的干燥步骤之后，使用镊子将盖玻片移回盖玻片盒中。这些盖玻片可以在未来1-2个月内使用。旧的盖玻片将开始失去其涂层，应丢弃。 2. 微管蛋白制剂 注意：购买的微管蛋白是冻干粉末，未标记或标有荧光基团。冻干的微管蛋白储存在−80°C冰箱中。以下程序用于将未标记的微管蛋白与标记的微管蛋白以有利于可视化的比例混合。 从−80°C冰箱中取出一等分试样的含有1mg冻干微管蛋白粉的未标记微管蛋白，并将其保存在冰上。向试管中加入200μL冷PEM-80，使微管蛋白浓度达到5mg / mL。将其保存在冰上10分钟以溶解所有冻干物。 从−80°C冰箱中取出含有20μg冻干微管蛋白粉末的罗丹明标记的微管蛋白等分试样，并将其保存在冰上。向试管中加入4μL冷PEM-80，使微管蛋白浓度达到5mg / mL。将其保存在冰上10分钟以完全溶解冻干物。 溶解后，将100μL未标记的重悬微管蛋白溶液加入到罗丹明标记的微管蛋白溶液中。移液器6x-7x非常缓慢地混合。如果聚集体可见，则将溶解的微管蛋白以90，000× g 离心10分钟，通过丢弃沉淀并保留上清液来除去聚集体。这种微管蛋白混合物将产生~4%标记的微管蛋白。 将剩余的100μL未标记的微管蛋白滴冻到液氮（LN2）中，并将其储存在-80°C以用于额外的微管蛋白混合物。 取标记的微管蛋白混合物并等分到七个管中，每个管15μL。每个等分试样可用于单个实验室。滴冻剩余的等分试样并将其储存在-80°C以备将来实验。 3. MAP65净化 注意：MAP65不是商业上可获得的，因此需要为这项工作进行净化。该协议之前已在若干出版物23，29中详细阐述。 将 MAP65 质粒和 GFP-MAP65 质粒转化为 BL21 细菌菌株以进行蛋白表达。 在600nm处将BL21细菌培养成0.6-1的光密度。使用lac操作器诱导蛋白质产生，并在一夜之间生长细菌。 沉淀培养物并裂解细菌。 离心后收集裂解物，并用具有可用于结合6x-组氨酸标签的镍离子的磁珠孵育。 使用咪唑洗脱蛋白质并脱盐。 用液氮滴冻蛋白质并将其储存在−80°C以在1年内使用。 4. 流室的组装 注意：实验在由载玻片和硅烷化盖玻片制成的流动室中进行（图3）。 取载玻片，按顺序使用ddH2O，乙醇和ddH2O清洁。每次冲洗之间用不起毛的实验室湿巾擦干。 使用一段双面胶带创建流路径。使用戴手套的手，将胶带切成~25-30毫米的长度。纵向拆分磁带以创建两条较细的条带。将两条胶带放在载玻片上，它们之间约5-8毫米。注意：由于胶带的厚度标准化为约80-100μm，因此胶带片之间的路径宽度将决定腔室中的体积。 将硅烷化盖玻片放在流道的顶部。用笔背面轻轻按压胶带区域，将载玻片和盖玻片密封到双面胶带上。确保整个区域保持良好的密封;当密封性良好时，胶带应从半透明变为透明。 取下边缘上多余的胶带，用剃须刀片切割胶带，从流室入口仅留下1毫米。 根据需要，用实验参数的信息标记腔室。 5. 触觉实验 注意：一旦产生所有试剂和耗材，它们就可用于在流动室中对微管触觉进行成核和聚合。 收集所有要使用的试剂。将它们解冻在冰上，并在工作时将它们储存在冰上。为实验制作几个流动室。 每个实验使用一个流室。通过在溶解在PEM-80中的20μL5%非离子嵌段共聚物表面活性剂（材料表）中流动，用聚合物刷涂覆流动室表面，并在腔室两端滴小滴以防止内部形成气泡。将其保存在潮湿的腔室中（即，用湿的无绒实验室湿巾培养皿）直到准备使用（至少5-7分钟）。 在无菌管中，混合以下物质以产生微管蛋白- MAP混合物：9.5μLPEM-80;4微升10毫升转基因酚酯;4 μL 5%普隆尼克-F127;1 μL 1M 数码热脱硫;1μL葡萄糖;2微升聚乙二醇;从步骤2.5开始，12μL5mg / mL微管蛋白混合物（13.6μM终浓度）;和 5.5 μL MAP65 工作储备液，其中 10% 为 GFP-MAP65，用于可视化。混合时保持在冰上。注意：建议使用容积式移液器处理粘性PEG溶液。切尖后可以使用常规移液器，使开口更大;但是，这种方法不太准确。 通过移液混合5x-6x。 在加入腔室之前，将1μL葡萄糖氧化酶（0.5mg / mL）和过氧化氢酶（0.15mg / mL）（脱氧）的预混合溶液加入微管蛋白- MAP混合物中并混合7x-8x。将溶液的总体积（40μL）分成两部分，在单独的腔室中使用。 将微管蛋白-MAP混合物流入腔室。由于腔室中已经含有非离子嵌段共聚物表面活性剂，因此如果不去除旧液体，就无法添加更多液体。为此，请在腔室的另一端使用一张滤纸或无绒的实验室湿巾，通过毛细管作用除去液体。 一旦样品完全在腔室内，使用5分钟环氧树脂密封腔室的两端，并将其保持在37°C下约30分钟以成核并生长微管触觉。 6. 荧光显微镜 使用荧光显微镜对触觉进行成像。注意：全内反射荧光显微镜或旋转盘共聚焦显微镜可以很好地去除游离微管蛋白的背景荧光，但是一旦形成，通过常规的落射荧光甚至透射光显微镜也可以看到触觉，这使得该过程无需专用设备即可进入。 使用1.2 NA或更高的数值孔径（NA）物镜，放大倍率为60倍或更高，以收集足够的荧光光。这些物镜通常需要浸入ddH2O或油中。 使用立体图像感应器或 CCD 相机记录图像。在相机上使用 108 nm 的有效像素大小。注：像素大小取决于相机和所使用的放大倍率，在本例中为 60 倍或 100 倍，具有高数值孔径（1.2 或 1.49 NA）。可以在相机之前使用额外的图像扩展器来实现所需的像素尺寸。 使用设置为该温度的环境室将样品保持在37°C。或者，使用其他阶段加热器，包括热空气级加热器和带循环温水的客观温控环。 使用对所需荧光正确的激发源。对于罗丹明微管蛋白，在样品上使用功率至少为1 mW的561nm激光器，对于GFP-MAP65，使用488nm激光器，在样品处使用至少1 mW功率的488nm激光器。注意：如果使用宽视场落射荧光显微镜，请使用激发：540 ± 12.5 nm，二向色性：545 nm ± 12.5 nm 截止时间和发射：575 nm 长通量的罗丹明滤光片立方体，其激发：480 ± 15 nm，二向色性：505 nm ± 15 nm 截止，发射：515 nm 长通。 拍摄至少 10 张不同区域的图像，以拍摄 100 多个触觉。在红色和绿色通道中拍摄图像，并将其另存为 16 位 tiff 图像以供分析。确保照明功率和曝光时间使照相机的强度刻度不饱和。 7. 光漂白后的荧光恢复 （FRAP） 注意：为了研究触头内部成分的迁移率，使用了FRAP。FRAP的工作原理是光漂白罗丹明标记的微管蛋白和GFP标记的MAP65触头的选定部分，然后观察该区域中荧光随时间的恢复。回收率取决于被光漂白物种的周转率。这种周转率可能取决于扩散和结合反应。对于 MAP65 与触头的结合，可以估计绑定汇率。FRAP使用额外的405 nm激光系统执行，该系统可以扫描任何形状的激光。执行FRAP有许多可能性，包括使用透射灯和光孔对局部区域14进行光漂白。 在腔室中选择一个孤立的触觉，以创建一个覆盖部分触觉和周围溶液的感兴趣区域（ROI）。 使用带有额外405nm激光的显微镜进行FRAP，以同时光漂白微管蛋白和MAP65。或者，可以通过光圈14的场停止使用明亮的灯。根据经验调整光漂白系统的比强度，以避免在漂白过程中损坏蛋白质。 在光漂白之前，将触觉记录为时间序列电影30-60秒，以获取有关漂白前强度的信息。记录红色和绿色通道。 通过根据需要用激光或灯暴露ROI来光漂白触头，以便在不损坏触头的情况下进行光漂白。根据经验确定强度和时间。 在光漂白后，继续在两个彩色通道中录制短片5-10分钟，或直到恢复似乎达到平衡。 目视检查 GFP-MAP65 通道的恢复情况。 8. 数据分析 注意：对触觉图像进行了定量分析，以了解通过不同的拥挤剂，离子条件和其他因素的添加施加的环境变化的影响。 触头形状表征从用共聚焦显微镜拍摄的红色和绿色图像中量化触头的长度和宽度。 使用斐济/图像J打开图像。 如果原始数据以 16 位为单位，请根据需要调整亮度和对比度。选择 “图像>调整>亮度和对比度 ”以调整图像，以便能够清楚地看到触觉。在不应用设置的情况下调整亮度和对比度，以免意外更改强度数据。 一旦触头清晰可见，选择要测量的良好触头（图4Bi）。确保触头清晰可见，不与任何其他触头或聚集体重叠，并且没有弯曲或弯曲，以便能够使用直线测量工具。 接下来，检查是否为图像设置了正确的像素大小。显微镜图像带有有关像素大小的元数据。当使用没有元数据的其他相机或可以更改预期有效像素大小的外部图像扩展系统时，请手动调整像素大小。在斐济/ImageJ 中，转到 分析>设置比例 以设置正确的像素转换。 使用斐济/ImageJ工具栏中的 直线 工具，单击触觉的一端，然后将光标拖动到触头的另一端（图4Bii）。选择线 ROI 后，选择 分析>测量 以测量长度。如果默认情况下未测量长度，请确保在“ 分析>设置 测量值”对话框中将测量值设置为包括长度。注意：通常，使用 “直线” 工具进行测量时，它会给出所绘制线条的长度和角度。例如， 图4Bii 显示了一条在触头的侧面绘制的直线，以使后者可见，但直接在触头上进行测量。 进行测量后，使用工具栏中的 “文本” 工具标记触觉。创建文本框，添加数字标签，然后选择 “编辑>绘制 ”以将标签固定到图像中。将图像另存为单独的 ROI 文件。注意：标记并保存此文件可让调查人员从原始数据中知道哪个测量值对应于哪个触觉。确保测量每个触觉一次。 测量整个图像的触觉后，将“ 结果 ”窗口中的数据保存到逗号或制表符分隔的文本文件中（使用 “文件>另存为”），然后在电子表格程序中打开数据以将数据解析为数字。将所有数据（原始图像数据、ROI 图像和结果文本文件）一起收集到具有适当命名约定的文件夹中，以保持所有内容井井有条。注意：虽然触头长度测量是用手进行的，但鉴于触头宽度较窄，最好采用不同的方法来测量触头宽度（见下文）以减少测量误差。 使用图像 J/斐济，使用直线工具绘制 直线 区域。将线绘制为与触状长轴垂直的平分扇区（图4Bii）。 选择分析>绘图剖面图以创建线性双扇区的强度剖面图（图 4Biii）。将出现一个绘图。要从绘图中检索并保存数据，请选择左下角的“列表”按钮;这将沿绘制的线的长度生成强度数据的文本文件列表。将文本文件另存为.csv或.txt文件。 在合适的程序中打开文本文件，如 MatLab、蟒蛇 （sciPy） 或其他程序。用高斯函数的形式拟合强度数据：，其中 I（x） 是沿长度 x 的灰度值;B是背景级别;A是高斯振幅;μ是高斯的均值或中心;σ是高斯的标准差。 报告 2σ 为触头的宽度。通过计算高斯（不包括背景）下的面积来估计触头中微管的强度。注意：如果图像在相机的线性强度范围内，并且以相同的曝光时间和激发强度拍摄，则可以比较积分强度以估计触头中微管的相对数量。 熔断分析注意：测试微管迁移率的实验和MAP65使用FRAM来记录由于分子运动引起的特定光漂白和强度恢复（图5A）。数据是使用ImageJ/斐济从图像时间序列数据中量化的。 使用图像J/斐济打开电影数据。 随着时间的推移注册堆栈（时间序列数据）以消除漂移。使用 堆栈注册 插件以及辅助的 涡轮重置 插件;有关使用插件的说明，请参阅 材料表中给出的网络链接。选择平移以移动帧的位置，从而注册图像。 注册图像以消除漂移后，通过选择“图像” >“变换”>“旋转”，旋转图像，使触觉在帧中垂直或水平。选择要旋转的角度，然后使用 “预览” 确定触觉是否旋转得足够快。当预览显示触觉是垂直或水平时，选择“ 确定” 以旋转影片中的所有图像。 使用工具栏中的矩形选择工具在触觉的光漂白区域上创建矩形截面。使用图像>堆栈>测量堆栈记录每帧的 ROI 区域的集成强度。使用“分析”将测量类型设置为“集成密度>设置测量值”。通过选择“文件”（>另存为）将“结果”窗口中显示的分析强度数据保存为.csv或.txt格式的文本文件。注意： 图5B 显示了在漂白区域中测量的微管和GFP-MAP65通道的原始16位强度数据的示例。 由于成像引起的光漂白，图像的整体强度将随着时间的推移而全局褪色，因此必须纠正这种全局光漂白。为此，请使用相同的 ROI 大小（步骤 8.2.4.），并将其移动到图像背景中不可见微管或 MAP65 的区域。按照步骤 8.2.4 中所述测量堆栈的集成强度。将结果另存为第二个文本文件。注： 图5B 显示了在背景区域中为微管和GFP-MAP65通道测量的原始16位强度数据的示例。 要校正背景褪色，请将触头上的信号强度除以同一时间点的背景强度。将 我校正的 （t） 计算为： ，其中 IS （t）（信号）是在漂白区域进行的测量， IBG （t）（噪声）是在背景区域进行的测量（图5C）。这将计算每帧的信噪比，并减去噪声。 然后，使用 将数据重新缩放到 0 和 1 之间的范围，其中 Imin 和 Imax 分别表示 I校正 数据在整个时间内的全局最小值和最大值（图 5C）。 将此数据拟合到以下形式的衰减指数： ，其中 A 是恢复的振幅，τ 是恢复的时间刻度（图 5C）。