提出了一种通过免疫标记传入突触结构和毛细胞,在老年组织中淬灭自发荧光,解剖和估计耳蜗的长度以及量化通过共聚焦成像获得的图像堆栈中的突触来处理年轻成人和老年沙鼠耳蜗的方案。
连接内部毛细胞和传入听觉神经纤维的带状突触的缺失被认为是年龄相关性听力损失的原因之一。检测带状突触丢失的最常见方法是免疫标记,因为它允许从单个耳蜗中的多个视点进行定量采样。然而,感兴趣的结构深埋在骨耳蜗内。沙鼠被用作年龄相关听力损失的动物模型。在这里,描述了固定的常规方案,免疫标记沙鼠耳蜗整个支架,共聚焦成像以及量化带状突触数量和体积。此外,还强调了与从有价值的老年人那里获得优质材料相关的特殊挑战。
沙鼠被安乐死,要么心血管灌注,要么它们的鼓膜大疱被小心地从头骨中解剖出来。耳蜗在顶点和基部打开,并直接转移到固定剂中。无论初始方法如何,耳蜗都会被后固定并随后脱钙。然后用针对突触前和突触后结构和毛细胞的一抗标记组织。接下来,将耳蜗与二级荧光标记抗体一起孵育,这些抗体对各自的主要抗体具有特异性。然后用自发荧光淬灭剂处理老年沙鼠的耳蜗,以减少老年动物组织通常实质性的背景荧光。
最后,将耳蜗解剖成6-11节。重建整个人工耳蜗长度,以便可靠地确定个体之间的特定人工耳蜗位置。按顺序获取的共聚焦图像堆栈有助于可视化所选位置的毛细胞和突触。共聚焦堆栈被解卷积,突触要么使用ImageJ手动计数,要么使用Matlab中定制的图像分析程序对突触结构进行更广泛的量化。
与年龄相关的听力损失是世界上最常见的疾病之一,影响着世界上三分之一以上的65岁及以上人口1。其根本原因仍在争论中,并正在积极研究,但可能包括连接内毛细胞(IHC)和传入听觉神经纤维的特殊突触的丧失2。这些带状突触包括突触前结构,其囊泡充满与其相连的神经递质谷氨酸盐,以及突触后α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异噁唑丙酸(AMPA)谷氨酸受体3,4,5。在沙鼠中,约20个传入听觉神经纤维接触一个IHC6,7,8。IHC上面向莫迪奥卢斯的纤维与大突触带相对,而连接IHC柱侧的纤维则面向小突触带(即,在猫9,沙鼠7,豚鼠10和小鼠3,11,12,13,14中)。此外,在沙鼠中,突触前带和突触后谷氨酸斑块的大小正相关7,14。与IHC的双极侧的大带相对的纤维口径小,自发率低,阈值高15。有证据表明,低自发率纤维比位于IHC15柱侧的高自发性低阈值纤维更容易受到噪声暴露10和耳毒性药物16的影响。
带状突触的丧失是耳蜗神经年龄相关性听力损失中最早的退行性事件,而螺旋神经节细胞及其传入听觉神经纤维的丧失则落后于17,18。电生理相关性包括听觉脑干反应17 和复合动作电位8的记录;然而,这些并不反映突触丢失的微妙之处,因为低自发率纤维不有助于这些措施16。更有希望的电生理学指标是质量电位衍生的神经指数19 和周震颤时间响应20。然而,只有当动物除了听觉神经纤维丧失之外没有其他耳蜗病理影响剩余听觉神经纤维的活动时,这些才是可靠的8。此外,沙鼠的行为评估阈值与突触数21无关。因此,只有通过直接检查耳蜗组织,才能可靠地定量存活的带状突触,从而确定功能性听觉神经纤维的数量。
蒙古沙鼠(Meriones unguiculatus)是研究与年龄相关的听力损失的合适动物模型。它的寿命短,具有与人类相似的低频听力,易于维护,并且与与年龄相关的听力损失相关的人类病理学表现出相似性2,22,23,24。沙鼠在达到36个月大时被认为是衰老的,这接近其平均寿命的结束22。重要的是,在安静环境中饲养和老化的沙鼠中已经证明了与年龄相关的带状突触丧失8,21。
在这里,提出了一种免疫标记,解剖和分析不同年龄的沙鼠(从年轻人到老年人)的耳蜗的方案。使用针对前突触 (CtBP2)、突触后谷氨酸受体贴片 (GluA2) 和 IHC (myoVIIa) 成分的抗体。应用自发荧光淬灭剂,减少老化耳蜗的背景,使荧光信号完好无损。此外,还描述了如何解剖耳蜗以检查感觉上皮和纹状血管。测量耳蜗长度是为了能够选择与特定最佳频率相对应的不同耳蜗位置25。突触数的定量是使用免费软件ImageJ26进行的。使用Matlab中编写的软件自定义来执行单个HC中突触体积和位置的额外定量。该软件不公开,因为作者缺乏提供专业文档和支持的资源。
使用该协议中概述的方法,可以从年轻成人和老年沙鼠的耳蜗中免疫标记IHC和突触结构,通过突触前和突触后元素的共定位来识别假定的功能突触,将它们分配给单个IHC,并量化它们的数量,体积和位置。这种方法中使用的抗体还标记外毛细胞(OHCs; myoVIIa)及其突触前带。此外,IHC和OHC免疫标记的可行替代方案是针对乙铁林的抗体,OHCs看起来比IHC暗淡得多。
灌注可以使用两…
The authors have nothing to disclose.
作者感谢Lichun Zhang帮助建立了该方法和荧光显微镜服务部门,卡尔·冯·奥西茨基大学奥尔登堡分校,用于使用成像设施。这项研究由德国卓越战略-EXC 2177/1下的德国研究基金会(DFG)资助。
Albumin Fraction V biotin-free | Carl Roth | 0163.2 | |
anti-CtBP2 (IgG1 monoclonal mouse) | BD Biosciences, Eysins | 612044 | |
anti-GluA2 (IgG2a monoclonal mouse) | Millipore | MAB39 | |
anti-mouse (IgG1)-AF 488 | Molecular Probes Inc. | A21121 | |
anti-MyosinVIIa (IgG polyclonal rabbit) | Proteus Biosciences | 25e6790 | |
Blade Holder & Breaker – Flat Jaws | Fine Science Tools | 10052-11 | |
Bonn Artery Scissors – Ball Tip | Fine Science Tools | 14086-09 | |
Coverslip thickness 1.5H, 24 x 60 mm | Carl Roth | LH26.1 | |
Disposable Surgical Blade | Henry Schein | 0473 | |
donkey anti-rabbit (IgG)-AF647 | Life Technologies-Molecular Probes | A-31573 | |
Dumont #5 – Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
Dumont #5SF Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
Ethanol, absolute 99.8% | Fisher Scientific | 12468750 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid | Carl Roth | 8040.2 | |
Excel | Microsoft Corporation | ||
Feather Double Edge Blade | PLANO | 112-9 | |
G19 Cannula | Henry Schein | 9003633 | |
goat anti-mouse (IgG2a)-AF568 | Invitrogen | A-21134 | |
Heparin | Ratiopharm | N68542.04 | |
Huygens Essentials | Scientific Volume Imaging | ||
ImageJ | Fiji | ||
Immersol, Immersion oil 518F | Carl Zeiss | 10539438 | |
Intrafix Primeline Classic, 150 cm (mit Datamatrix Code auf der Sterilverpackung) | Braun | 4062957E | |
ISM596D | Ismatec | peristaltic pump | |
KL 1600 LED | Schott | 150.600 | light source for stereomicroscope |
Leica Application suite X | Leica Microsystem CMS GmbH | ||
Leica TCS SP8 system | Leica Microsystem CMS GmbH | ||
Matlab | The Mathworks Inc. | ||
Mayo Scissors Tungston Carbide ToghCut | Fine Science Tools | 14512-17 | |
Mini-100 Orbital-Genie | Scientific Industries | SI-M100 | for use in cold environment |
Narcoren (pentobarbital) | Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH | ||
Nikon Eclipse Ni-Ei | Nikon | ||
NIS Elements | Nikon Europe B.V. | ||
Paraformaldehyde | Carl Roth | 0335.3 | |
Petri dish without vents | Avantor VWR | 390-1375 | |
Phosphate-buffered saline: | |||
Disodium phosphate | AppliChem | A1046 | |
Monopotassium phosphate | Carl Roth | 3904.1 | |
Potassium chloride | Carl Roth | 6781.1 | |
Sodium chloride | Sigma Aldrich | 31434-M | |
Screw Cap Containers | Sarstedt | 75.562.300 | |
Sodium azide | Carl Roth | K305.1 | |
Student Adson Forceps | Fine Science Tools | 91106-12 | |
Student Halsted-Mosquito Hemostat | Fine Science Tools | 91308-12 | |
Superfrost Adhesion Microscope Slides | Epredia | J1800AMNZ | |
Triton X | Carl Roth | 3051.2 | |
TrueBlack Lipofuscin Autofluorescence Quencher | Biotium | 23007 | |
Vannas Spring Scissors, 3mm | Fine Science Tools | 15000-00 | |
Vectashield Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
Vibrax VXR basic | IKA | 0002819000 | |
VX 7 Dish attachment for Vibrax VXR basic | IKA | 953300 | |
Wild TYP 355110 (Stereomicroscope) | Wild Heerbrugg | not available anymore |