Компетентная модель гепатоцитов, исследующая проникновение вируса гепатита В через таурохолат натрия, котранспортирующий полипептид в качестве терапевтической мишени

Инфекция, вызванная вирусом гепатита В (HBV), считается опасным для жизни заболеванием во всем мире. Хроническая инфекция HBV сопряжена с риском цирроза печени и гепатоцеллюлярной карциномы¹. Современное лечение анти-HBV фокусируется в основном на поствирусном введении с использованием аналогов нуклеоса (t)ide (NA) и интерферона-альфа (IFN-α)^2,3. Открытие ингибитора входа HBV, Myrcludex B, определило новую мишень для анти-HBV агентов⁴. Комбинация ингибиторов входа и АНА при хроническом HBV значительно снизила вирусную нагрузку по сравнению с теми, которые нацелены только на репликацию вируса ^5,6. Однако классическая модель гепатоцитов для скрининга ингибиторов входа HBV ограничена низкими уровнями вирусных рецепторов (котранспортирующий полипептид таурохолата натрия, NTCP). Сверхэкспрессия hNTCP в клетках гепатомы (т.е. HepG2 и Huh7) улучшает инфекционность HBV ^7,8. Тем не менее, эти клеточные линии экспрессируют низкие уровни ферментов, метаболизирующих лекарства фазы I и II, и проявляют генетическую нестабильность⁹. Модели гепатоцитов, которые могут помочь нацелиться на различные механизмы соединений-кандидатов против HBV, такие как превирусное вступление, связывание NTCP и проникновение вируса, ускорят идентификацию и разработку эффективных комбинированных схем. Исследование анти-HBV активности куркумина прояснило ингибирование проникновения вируса в качестве нового механизма в дополнение к прерыванию поствирусного входа. Этот протокол детализирует модель хозяина для скрининга входных молекул¹⁰ против HBV.

Целью этого метода является изучение потенциальных анти-HBV соединений для ингибирования проникновения вируса, особенно блокирования связывания и транспорта NTCP. Поскольку экспрессия NTCP является критическим фактором для входа в HBV и инфекции, мы оптимизировали протокол созревания гепатоцитов, чтобы максимизировать уровни NTCP¹¹. Кроме того, этот протокол может дифференцировать ингибирующее действие на вход HBV как ингибирование прикрепления HBV по сравнению с ингибированием интернализации. Анализ поглощения таурохолевой кислоты (ТЦА) также модифицировали с использованием метода на основе ИФА вместо радиоизотопа для представления переноса NTCP^12,13. Взаимодействие рецептора и лиганда было подтверждено их 3D структурами^14,15. Ингибирование функции NTCP может быть оценено путем измерения активности поглощения TCA¹⁶. Однако этот метод не предоставил прямых доказательств связывания NTCP с ингибиторами-кандидатами. Таким образом, связывание может быть исследовано с использованием различных методов, таких как поверхностный плазмонный резонанс¹⁷, ИФА, анализ теплового сдвига на основе флуоресценции (FTSA)¹⁸, FRET¹⁹, AlphaScreen и различные другие методы²⁰. Среди этих методов ITC является целевым стандартом в анализе связывания, поскольку он может наблюдать поглощение тепла или излучение почти в каждой реакции²¹. Сродство связывания (K_D) NTCP и соединений-кандидатов оценивали непосредственно с использованием ITC; эти значения сродства были более точными, чем те, которые были получены с использованием модели прогнозирования in silico ²².

Этот протокол охватывает методы созревания гепатоцитов, инфекции HBV и скрининга на ингибитор входа HBV. Вкратце, модель гепатоцитов была разработана на основе клеточных линий imHC и HepaRG. Культивируемые клетки дифференцировали в зрелые гепатоциты в течение 2 недель. Повышение уровня NTCP было обнаружено с помощью ПЦР в реальном времени, вестерн-блоттинга и проточной цитометрии¹¹. Вирион гепатита В (HBVcc) был получен и собран из HepG2.2.15. Дифференцированный imHC или HepaRG (d-imHC, d-HepaRG) профилактически лечили анти-HBV кандидатами за 2 ч до инокуляции вирионом HBV. Ожидаемым результатом эксперимента стала идентификация агентов, снижающих клеточный HBV и инфекционность. Анти-NTCP активность оценивали с использованием анализа поглощения TCA. Активность NTCP может быть подавлена агентами, которые специально связывали NTCP. Метод ITC был использован для исследования возможности интерактивного связывания, которое могло бы предсказывать ингибиторы и их белки-мишени, определяя сродство связывания (K_D) лиганда для рецептора посредством нековалентных взаимодействий биомолекулярного комплекса^23,24. Например, K_D ≥ 1 × 10³ мМ представляет собой слабое связывание, K_D ≥ 1 × 10⁶ мкМ представляет собой умеренное связывание, а K_D ≤ 1 × 10⁹ нМ представляет собой сильное связывание. ΔG напрямую коррелирует с связывающими взаимодействиями. В частности, реакция с отрицательным ΔG является экзергонической реакцией, указывающей на то, что связывание является спонтанным процессом. Реакция с отрицательным ΔH указывает на то, что процессы связывания зависят от водородной связи и сил Ван-дер-Ваальса. Как поглощение TCA, так и данные ITC могут быть использованы для скрининга агентов против HBV. Результаты этих протоколов могут обеспечить основу не только для скрининга против HBV, но и для взаимодействия с NTCP, оцениваемого через сродство связывания и транспортную функцию. В этой статье описывается подготовка и характеристика клеток-хозяев, экспериментальное проектирование и оценка входа анти-HBV вместе с сродством связывания NTCP.