Um Modelo de Hepatócito Competente Examinando a Entrada do Vírus da Hepatite B através do Polipeptídeo Cotransportador de Taurocolato de Sódio como Alvo Terapêutico

A infecção pelo vírus da hepatite B (HBV) é considerada uma doença com risco de vida em todo o mundo. A infecção crônica pelo VHB é carregada de risco de cirrose hepática e carcinoma hepatocelular¹. O tratamento anti-HBV atual concentra-se principalmente na entrada pós-viral usando análogos de nucleos(t)ide (NAs) e interferon-alfa (IFN-α)^2,3. A descoberta de um inibidor da entrada do VHB, o Myrcludex B, identificou um novo alvo para os agentes anti-VHB⁴. A combinação de inibidores de entrada e NAs no HBV crônico diminuiu significativamente a carga viral em comparação com aqueles que visam apenas a replicação viral ^5,6. No entanto, o modelo clássico de hepatócitos para a triagem de inibidores da entrada do HBV é limitado por baixos níveis de receptores virais (polipeptídeo cotransportador de taurocolato de sódio, NTCP). A superexpressão de hNTCP em células de hepatoma (ou seja, HepG2 e Huh7) melhora a infectividade do HBV ^7,8. No entanto, essas linhagens celulares expressam baixos níveis de enzimas metabolizadoras de drogas de fase I e II e apresentam instabilidade genética⁹. Modelos de hepatócitos que podem ajudar a direcionar mecanismos distintos de compostos anti-HBV candidatos, como entrada pré-viral, ligação ao NTCP e entrada viral, agilizariam a identificação e o desenvolvimento de regimes de combinação eficazes. O estudo para a atividade anti-HBV da curcumina elucidou a inibição da entrada viral como um novo mecanismo, além da interrupção da entrada pós-viral. Este protocolo detalha um modelo hospedeiro para a triagem de moléculas de entrada anti-HBV¹⁰.

O objetivo deste método é explorar compostos anti-HBV candidatos para inibição da entrada viral, especialmente bloqueando a ligação e o transporte de NTCP. Como a expressão de NTCP é um fator crítico para a entrada e infecção pelo HBV, otimizamos o protocolo de maturação de hepatócitos para maximizar os níveis de NTCP¹¹. Além disso, esse protocolo pode diferenciar o efeito inibitório sobre a entrada do HBV como inibição da ligação do HBV versus inibição da internalização. O ensaio de captação de ácido taurocólico (TCA) também foi modificado usando um método baseado em ELISA em vez de um radioisótopo para representar o transporte de NTCP^12,13. A interação receptor e ligante foi confirmada por suas estruturas 3D^14,15. A inibição da função NTCP pode ser avaliada pela mensuração da atividade de captação do TCA¹⁶. No entanto, esta técnica não forneceu evidências diretas de ligação do NTCP aos inibidores candidatos. Portanto, a ligação pode ser investigada usando várias técnicas, como ressonância plasmônica^{de superfície 17}, ELISA, ensaio de deslocamento térmico baseado em fluorescência (FTSA)¹⁸, FRET¹⁹, AlphaScreen e vários outros métodos²⁰. Dentre essas técnicas, a ITC é um padrão de meta na análise de ligação, pois pode observar absorção ou emissão de calor em quase todas as reações²¹. A afinidade de ligação (K_D) do NTCP e dos compostos candidatos foi avaliada diretamente por meio do ITC; esses valores de afinidade foram mais precisos do que os obtidos por meio do modelo de predição in silico ²².

Este protocolo abrange técnicas de maturação de hepatócitos, infecção por HBV e triagem para inibidor de entrada de HBV. Resumidamente, um modelo de hepatócitos foi desenvolvido com base em linhagens celulares imHC e HepaRG. As células cultivadas foram diferenciadas em hepatócitos maduros dentro de 2 semanas. A regulação positiva dos níveis de NTCP foi detectada por PCR em tempo real, western blot e citometria de fluxo¹¹. O virion da hepatite B (HBVcc) foi produzido e coletado da HepG2.2.15. O imHC ou HepaRG diferenciado (d-imHC, d-HepaRG) foi tratado profilaticamente com os candidatos anti-HBV 2 h antes da inoculação com virion HBV. O resultado esperado do experimento foi a identificação dos agentes que diminuem o HBV celular e a infectividade. A atividade anti-NTCP foi avaliada usando o ensaio de captação de TCA. A atividade do NTCP pode ser suprimida pelos agentes que vincularam especificamente o NTCP. A técnica ITC foi empregada para investigar a viabilidade de ligações interativas que pudessem predizer inibidores e suas proteínas-alvo, determinando a afinidade de ligação (K_D) do ligante pelo receptor via interações não covalentes do complexo biomolecular^23,24. Por exemplo, K D ≥ 1 × 10³ mM representa ligação fraca, K D ≥ 1 × 10⁶ μM representa ligação moderada e K _D ≤ 1 × 10⁹ nM representa ligação forte. O ΔG está diretamente correlacionado com as interações de ligação. Em particular, uma reação com ΔG negativo é uma reação exergônica, indicando que a ligação é um processo espontâneo. Uma reação com um ΔH negativo indica que os processos de ligação dependem da ligação de hidrogênio e das forças de Van der Waals. Tanto a aceitação do TCA quanto os dados do ITC podem ser usados para rastrear agentes de entrada anti-HBV. Os resultados desses protocolos podem fornecer uma base não apenas para a triagem anti-HBV, mas também para a interação com o NTCP, conforme avaliado por meio da afinidade de ligação e da função de transporte. Este trabalho descreve a preparação e caracterização da célula hospedeira, o desenho experimental e a avaliação da entrada anti-HBV, juntamente com a afinidade de ligação do NTCP.