Un modello di epatociti competente che esamina l'ingresso del virus dell'epatite B attraverso il taurococolato di sodio che trasporta il polipeptide come bersaglio terapeutico

L’infezione da virus dell’epatite B (HBV) è considerata una malattia pericolosa per la vita in tutto il mondo. L’infezione cronica da HBV è carica di un rischio di cirrosi epatica e carcinoma epatocellulare¹. L’attuale trattamento anti-HBV si concentra principalmente sull’ingresso post-virale utilizzando analoghi nucleos(t)ide (NAs) e interferone-alfa (IFN-α)^2,3. La scoperta di un inibitore dell’ingresso dell’HBV, Myrcludex B, ha identificato un nuovo bersaglio per gli agenti anti-HBV⁴. La combinazione di inibitori di ingresso e NA nell’HBV cronico ha ridotto significativamente la carica virale rispetto a quelli mirati alla sola replicazione virale ^5,6. Tuttavia, il modello classico di epatociti per lo screening degli inibitori dell’ingresso dell’HBV è limitato da bassi livelli di recettori virali (polipeptide di cotrasporto del taurocolato di sodio, NTCP). La sovraespressione di hNTCP nelle cellule di epatoma (cioè HepG2 e Huh7) migliora l’infettività dell’HBV ^7,8. Tuttavia, queste linee cellulari esprimono bassi livelli di enzimi che metabolizzano i farmaci di fase I e II e mostrano instabilità genetica⁹. I modelli di epatociti che possono aiutare a colpire meccanismi distinti di composti anti-HBV candidati come l’ingresso previrale, il legame NTCP e l’ingresso virale accelererebbero l’identificazione e lo sviluppo di regimi di combinazione efficaci. Lo studio per l’attività anti-HBV della curcumina ha chiarito l’inibizione dell’ingresso virale come un nuovo meccanismo oltre all’interruzione post-ingresso virale. Questo protocollo descrive un modello ospite per lo screening delle molecole di ingresso anti-HBV¹⁰.

L’obiettivo di questo metodo è quello di esplorare i composti anti-HBV candidati per l’inibizione dell’ingresso virale, in particolare bloccando il legame e il trasporto NTCP. Poiché l’espressione di NTCP è un fattore critico per l’ingresso e l’infezione da HBV, abbiamo ottimizzato il protocollo di maturazione degli epatociti per massimizzare i livelli di NTCP¹¹. Inoltre, questo protocollo può differenziare l’effetto inibitorio sull’ingresso dell’HBV come inibizione dell’attaccamento dell’HBV rispetto all’inibizione dell’internalizzazione. Anche il test di assorbimento dell’acido taurocolico (TCA) è stato modificato utilizzando un metodo basato su ELISA anziché un radioisotopo per rappresentare il trasporto NTCP^12,13. L’interazione tra recettore e ligando è stata confermata dalle loro strutture 3D^14,15. L’inibizione della funzione NTCP può essere valutata misurando l’attività di captazione del TCA¹⁶. Tuttavia, questa tecnica non ha fornito prove dirette del legame NTCP ai candidati inibitori. Pertanto, il legame può essere studiato utilizzando varie tecniche, come la risonanza plasmonica di superficie 17, ELISA, saggio di spostamento termico basato sulla fluorescenza (FTSA) ¹⁸, FRET¹⁹, AlphaScreen e vari altri metodi²⁰. Tra queste tecniche, l’ITC è uno standard obiettivo nell’analisi di legame perché può osservare l’assorbimento o l’emissione di calore in quasi tutte le reazioni²¹. L’affinità di legame (K_D) di NTCP e composti candidati è stata valutata direttamente utilizzando ITC; Questi valori di affinità erano più precisi di quelli ottenuti utilizzando il modello di previsione in silico ²².

Questo protocollo copre le tecniche di maturazione degli epatociti, l’infezione da HBV e lo screening per l’inibitore dell’ingresso dell’HBV. In breve, è stato sviluppato un modello di epatociti basato su linee cellulari imHC e HepaRG. Le cellule coltivate sono state differenziate in epatociti maturi entro 2 settimane. La sovraregolazione dei livelli di NTCP è stata rilevata utilizzando la PCR in tempo reale, il western blot e la citometria a flusso¹¹. Il virione dell’epatite B (HBVcc) è stato prodotto e raccolto da HepG2.2.15. L’imHC differenziato o HepaRG (d-imHC, d-HepaRG) è stato trattato profilatticamente con i candidati anti-HBV 2 ore prima dell’inoculazione con il virione HBV. Il risultato atteso dell’esperimento era l’identificazione degli agenti che riducono l’HBV cellulare e l’infettività. L’attività anti-NTCP è stata valutata utilizzando il test di assorbimento TCA. L’attività NTCP potrebbe essere soppressa dagli agenti che hanno associato specificamente NTCP. La tecnica ITC è stata impiegata per studiare la fattibilità di un legame interattivo che potrebbe prevedere gli inibitori e le loro proteine bersaglio, determinando l’affinità di legame (K_D) del ligando per il recettore attraverso interazioni non covalenti del complesso biomolecolare^23,24. Ad esempio, K D ≥ 1 × 10³ mM rappresenta il legame debole, K D ≥ 1 × 10⁶ μM rappresenta un legame moderato e K _D ≤ 1 × 10⁹ nM rappresenta un legame forte. Il ΔG è direttamente correlato con le interazioni di legame. In particolare, una reazione con ΔG negativo è una reazione esoergonica, che indica che il legame è un processo spontaneo. Una reazione con un ΔH negativo indica che i processi di legame dipendono dal legame idrogeno e dalle forze di Van der Waals. Sia l’assorbimento del TCA che i dati ITC potrebbero essere utilizzati per lo screening degli agenti di ingresso anti-HBV. I risultati di questi protocolli possono fornire una base non solo per lo screening anti-HBV, ma anche per l’interazione con NTCP valutata attraverso l’affinità di legame e la funzione di trasporto. Questo articolo descrive la preparazione e la caratterizzazione della cellula ospite, il disegno sperimentale e la valutazione dell’ingresso anti-HBV insieme all’affinità di legame NTCP.