Een competent hepatocytenmodel dat de toegang tot het hepatitis B-virus onderzoekt via natrium taurocholaat cotransporterend polypeptide als een therapeutisch doelwit

Hepatitis B-virus (HBV) infectie wordt wereldwijd beschouwd als een levensbedreigende ziekte. Chronische HBV-infectie is beladen met een risico op levercirrose en hepatocellulair carcinoom¹. De huidige anti-HBV-behandeling richt zich vooral op post-virale entry met behulp van nucleos(t)ide analogen (NAs) en interferon-alfa (IFN-α)^2,3. De ontdekking van een HBV-entryremmer, Myrcludex B, heeft een nieuw doelwit voor anti-HBV-middelen geïdentificeerd⁴. De combinatie van entryremmers en NA’s bij chronische HBV heeft de virale lading aanzienlijk verminderd in vergelijking met die gericht op virale replicatie alleen ^5,6. Het klassieke hepatocytenmodel voor de screening van HBV-entryremmers wordt echter beperkt door lage virale receptorniveaus (natrium taurocholaat cotransporting polypeptide, NTCP). De overexpressie van hNTCP in hepatoomcellen (d.w.z. HepG2 en Huh7) verbetert de HBV-infectiviteit ^7,8. Niettemin drukken deze cellijnen lage niveaus van fase I- en II-enzymen uit die geneesmiddelen metaboliseren en vertonen ze genetische instabiliteit⁹. Hepatocytenmodellen die kunnen helpen bij het richten op verschillende mechanismen van kandidaat-anti-HBV-verbindingen zoals previrale invoer, NTCP-binding en virale entry, zouden de identificatie en ontwikkeling van effectieve combinatieregimes versnellen. De studie voor anti-HBV-activiteit van curcumine heeft de remming van virale entry opgehelderd als een nieuw mechanisme naast onderbreking van de post-virale binnenkomst. Dit protocol beschrijft een gastheermodel voor de screening van anti-HBV-ingangsmoleculen¹⁰.

Het doel van deze methode is om kandidaat-anti-HBV-verbindingen te onderzoeken voor virale entry-remming, met name het blokkeren van NTCP-binding en transport. Omdat NTCP-expressie een kritieke factor is voor HBV-invoer en -infectie, hebben we het hepatocytenrijpingsprotocol geoptimaliseerd om NTCP-niveaus¹¹ te maximaliseren. Bovendien kan dit protocol het remmende effect op HBV-entry differentiëren als remming van HBV-aanhechting versus remming van internalisatie. De taurocholzuur (TCA) opnametest werd ook aangepast met behulp van een ELISA-gebaseerde methode in plaats van een radio-isotoop om NTCP-transport^12,13 weer te ^geven. De receptor- en ligandinteractie werd bevestigd door hun 3D-structuren^14,15. De remming van de NTCP-functie kan worden geëvalueerd door TCA-opnameactiviteit^{16 te} meten. Deze techniek leverde echter geen direct bewijs van NTCP-binding aan de kandidaat-remmers. Daarom kan de binding worden onderzocht met behulp van verschillende technieken, zoals oppervlakteplasmonresonantie¹⁷, ELISA, fluorescentie-gebaseerde thermische verschuivingstest (FTSA) ¹⁸, FRET¹⁹, AlphaScreen en verschillende andere methoden²⁰. Onder deze technieken is ITC een doelstandaard in bindingsanalyse omdat het warmteabsorptie of -emissie in bijna elke reactie kan observeren²¹. De bindingsaffiniteit (K_D) van NTCP en kandidaat-verbindingen werd direct geëvalueerd met behulp van ITC; deze affiniteitswaarden waren nauwkeuriger dan die verkregen met behulp van het in silico voorspellingsmodel²².

Dit protocol heeft betrekking op technieken in hepatocytenrijping, HBV-infectie en screening op HBV-entryremmer. In het kort werd een hepatocytenmodel ontwikkeld op basis van imHC- en HepaRG-cellijnen. De gekweekte cellen werden binnen 2 weken gedifferentieerd tot volwassen hepatocyten. De upregulatie van NTCP-niveaus werd gedetecteerd met behulp van real-time PCR, western blot en flowcytometrie¹¹. Hepatitis B-virion (HBVcc) werd geproduceerd en verzameld uit HepG2.2.15. De gedifferentieerde imHC of HepaRG (d-imHC, d-HepaRG) werd profylactisch behandeld met de anti-HBV-kandidaten 2 uur voorafgaand aan de inenting met HBV-virion. De verwachte uitkomst van het experiment was de identificatie van de middelen die cellulaire HBV en infectiviteit verminderen. Anti-NTCP-activiteit werd geëvalueerd met behulp van de TCA-opnametest. NTCP-activiteit kan worden onderdrukt door de agenten die specifiek NTCP hebben gebonden. De ITC-techniek werd gebruikt om de haalbaarheid te onderzoeken van interactieve binding die remmers en hun doeleiwitten kon voorspellen, waarbij de bindingsaffiniteit (K_D) van het ligand voor de receptor werd bepaald via niet-covalente interacties van het biomoleculaire complex^23,24. K_D ≥ 1 × 10³ mM staat bijvoorbeeld voor een zwakke binding, K_D ≥ 1 × 10⁶ μM voor matige binding en K_D ≤ 1 × 10⁹ nM voor een sterke binding. De ΔG is direct gecorreleerd met bindingsinteracties. In het bijzonder is een reactie met negatieve ΔG een exergonische reactie, wat aangeeft dat binding een spontaan proces is. Een reactie met een negatieve ΔH geeft aan dat de bindingsprocessen afhankelijk zijn van waterstofbinding en Van der Waalskrachten. Zowel TCA-opname- als ITC-gegevens kunnen worden gebruikt om te screenen op anti-HBV-entry agents. De uitkomsten van deze protocollen kunnen een basis vormen voor niet alleen anti-HBV-screening, maar ook voor de interactie met NTCP zoals beoordeeld door bindingsaffiniteit en transportfunctie. Dit artikel beschrijft de voorbereiding en karakterisering van gastheercellen, experimenteel ontwerp en evaluatie van de anti-HBV-ingang samen met de NTCP-bindingsaffiniteit.