一种通过牛磺胆酸钠共转运多肽作为治疗靶点检查乙型肝炎病毒进入的感受态肝细胞模型

乙型肝炎病毒（HBV）感染在世界范围内被认为是一种危及生命的疾病。慢性HBV感染有肝硬化和肝细胞癌^的风险1。目前的抗HBV治疗主要集中在使用核苷（酸）类似物（NAs）和干扰素-α（IFN-α^）进入病毒后2^，3。HBV进入抑制剂Myrcludex B的发现确定了抗HBV药物的新靶点⁴。与仅靶向病毒复制的抑制剂相比，慢性HBV中进入抑制剂和NAs的组合显着降低了病毒载量^5，6。然而，用于筛选HBV进入抑制剂的经典肝细胞模型受到低病毒受体水平（牛磺胆酸钠共转运多肽，NTCP）的限制。hNTCP在肝癌细胞（即HepG2和Huh7）中的过表达可提高HBV感染性^7，8。然而，这些细胞系表达低水平的I期和II期药物代谢酶，并表现出遗传不稳定性⁹。肝细胞模型可以帮助靶向候选抗HBV化合物的不同机制，如病毒前进入，NTCP结合和病毒进入，将加快有效联合方案的鉴定和开发。姜黄素抗HBV活性的研究阐明了抑制病毒进入作为病毒进入后中断的新机制。该协议详细介绍了用于筛选抗HBV进入分子的宿主模型¹⁰。

该方法的目标是探索用于抑制病毒进入的候选抗HBV化合物，特别是阻断NTCP结合和转运。由于NTCP表达是HBV进入和感染的关键因素，我们优化了肝细胞成熟方案，以最大限度地提高NTCP水平¹¹。此外，该方案可以将对HBV进入的抑制作用区分为抑制HBV附着与抑制内化。牛磺胆酸（TCA）摄取测定也使用基于ELISA的方法而不是放射性同位素进行修饰，以表示NTCP转运^12，13。受体和配体的相互作用通过它们的3D结构^14，15得到证实。NTCP功能的抑制可以通过测量TCA摄取活性^来评估16。然而，该技术并未提供NTCP与候选抑制剂结合的直接证据。因此，可以使用各种技术来研究结合，例如表面等离子体共振¹⁷，ELISA，基于荧光的热移位测定（FTSA）¹⁸，^FRET19，AlphaScreen和各种其他方法²⁰。在这些技术中，ITC是结合分析的目标标准，因为它几乎可以观察每个反应中的吸热或发射²¹。使用ITC直接评估NTCP和候选化合物的结合亲和力（K_D）;这些亲和力值比使用 计算机 预测模型²²获得的值更精确。

该协议涵盖了肝细胞成熟，HBV感染和HBV进入抑制剂筛查的技术。简而言之，基于imHC和HepaRG细胞系开发了肝细胞模型。培养的细胞在2周内分化为成熟的肝细胞。使用实时荧光定量PCR、蛋白质印迹和流式细胞术检测NTCP水平的上调¹¹。乙型肝炎病毒粒子（HBVcc）是从HepG2.2.15中产生和收集的。分化的imHC或HepaRG（d-imHC，d-HepaRG）在接种HBV病毒粒子前2小时用抗HBV候选物预防性处理。实验的预期结果是鉴定降低细胞HBV和感染性的药物。使用TCA摄取测定法评估抗NTCP活性。NTCP活性可以被特异性结合NTCP的代理抑制。采用ITC技术研究了可以预测抑制剂及其靶蛋白的交互式结合的可行性，通过生物分子复合物^23，24的非共价相互作用确定配体对受体的结合亲和力（K_D）。例如，K D ≥ 1 × 10³ mM代表弱结合，K D ≥ 1 × 10 6 μM代表中等结合，K _D ≤ 1 ×^{10 9} nM代表强结合。ΔG与结合相互作用直接相关。特别是，负ΔG的反应是用力反应，表明结合是一个自发过程。负ΔH的反应表明结合过程取决于氢键和范德华力。TCA摄取和ITC数据都可用于筛查抗HBV进入剂。这些方案的结果不仅可以为抗HBV筛查提供基础，还可以通过结合亲和力和转运功能评估与NTCP的相互作用。本文描述了宿主细胞的制备和表征、实验设计以及抗HBV条目以及NTCP结合亲和力的评估。