MALDI-TOF 질량 분광법을 이용한 효소적 분해로 인한 RNA 단편의 확인

MALDI-TOF ^1,2,3은 다양한 크기와 특성을 가진 분자의 특성화 및/또는 검출을 위해 널리 사용되는 기술입니다. 그것의 용도 중 일부는 천연 자원으로부터의 탄닌 검출⁴, 식품⁵의 대사 산물 이미징, 세포 약물 표적 또는 마커⁶의 발견 또는 모니터링, 임상 진단⁷과 같은 다양한 응용을 포함한다. 본 연구와 관련성 중 하나는 MALDI-TOF를 DNA 또는 RNA와 함께 사용하는 것이며, 올리고뉴클레오티드에 대한 사용은 삼십 년⁸ 이상으로 거슬러 올라가며, 몇 가지 한계가 지적되었다. 이 기술은 이제 바이오폴리머(⁹)를 특성화하고 화학적 및 생화학적 반응, 예를 들어 RNA 10에서 도금된 부위의 특성화, 가닥 절단^11,12에 따른 RNA 단편의 확인^, 또는 단백질-DNA 가교결합의 형성⁽¹³)을 식별/이해하기 위해 신뢰할 수 있고 일반적으로 사용되는 수단으로 진화되었다. . 따라서이 기술을 사용하는 중요한 측면을 설명하고 강조하는 것이 중요합니다. MALDI-TOF의 기초는 비디오 포맷 뿐만 아니라^{도 14}에서 설명되었으며, 여기서 더 이상 설명되지 않을 것이다. 더욱이, DNA 또는 단백질 맥락에서의 그의 적용은 상기 포맷^15,16,17에 이전에 기술되고 예시되었다.

효소적 가수분해 후에 형성된 RNA 단편을 검출하기 위한 프로토콜이 본원에 보고된다. 실험 모델은 우리 그룹¹⁸에 의해 발표 된 최근 발견에 기초하여 선택되었으며, 여기서 MALDI-TOF는 exoribonuclease Xrn-1과 산화 병변 8-oxoG를 포함하는 RNA의 올리고뉴클레오티드 사이의 독특한 반응성을 결정하기 위해 사용되었습니다. 20-뉴클레오티드 긴 가닥을 고체상 합성¹⁹를 통해 수득하였고, [5′-CAU GAA ACA A(8-oxoG)G CUA AAA GU] 및 [5′-CAU GAA ACA A(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU], Xrn-1은 앞서 기술된 보고서²⁰에 따라 발현되고 정제되었다. 간단히 말해서, Xrn-1²¹은 산화된 RNA²²를 포함한 여러 유형의 RNA를 분해하는 다양한 주요 생물학적 역할을 갖는 5′-3′ 엑소리보뉴클레아제이다. 효소의 처리성이 8-oxoG를 만나면 멈추는 것으로 밝혀졌으며, 이는 5′-인산화된 말단[5′-H2PO4-(8-옥소G)G CUA AAA GU], [5′-H2PO4-(8-oxoG)(8-oxoG) cua AAA gu], 및 [5′-_H2PO4-(8-oxoG) CUA AAA GU]¹⁸을 함유하는 RNA 단편으로 이어졌다.

마지막으로, 질량 분광법은 다양한 방법론을 통해 다른 목적에 적응할 수있는 강력한 방법이라는 점에 유의하는 것이 중요합니다^23,24; 따라서 올바른 이온화 방법과 다른 실험 설정을 선택하는 것이 가장 중요합니다.