Identification de fragments d’ARN résultant d’une dégradation enzymatique à l’aide de la spectrométrie de masse MALDI-TOF
Özet
MALDI-TOF a été utilisé pour caractériser des fragments obtenus à partir de la réactivité entre l’ARN oxydé et l’exoribonucléase Xrn-1. Le présent protocole décrit une méthodologie qui peut être appliquée à d’autres processus impliquant l’ARN et/ou l’ADN.
Abstract
L’ARN est un biopolymère présent dans tous les domaines de la vie, et ses interactions avec d’autres molécules et/ou espèces réactives, par exemple l’ADN, les protéines, les ions, les médicaments et les radicaux libres, sont omniprésentes. En conséquence, l’ARN subit diverses réactions qui incluent son clivage, sa dégradation ou sa modification, conduisant à des espèces biologiquement pertinentes avec des fonctions et des implications distinctes. Un exemple est l’oxydation de la guanine en 7,8-dihydro-8-oxoguanine (8-oxoG), qui peut se produire en présence d’espèces réactives de l’oxygène (ROS). Dans l’ensemble, les procédures qui caractérisent ces produits et transformations sont largement précieuses pour la communauté scientifique. À cette fin, la spectrométrie de masse à temps de vol par ionisation laser de désorption assistée par matrice (MALDI-TOF) est une méthode largement utilisée. Le présent protocole décrit comment caractériser les fragments d’ARN formés après un traitement enzymatique. Le modèle choisi utilise une réaction entre l’ARN et l’exoribonucléase Xrn-1, où la digestion enzymatique est arrêtée aux sites oxydés. Deux séquences d’ARN long de 20 nucléotides [5′-CAU GAA ACA A(8-oxoG)G CUA AAA GU] et [5′-CAU GAA ACA A(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU] ont été obtenues par synthèse en phase solide, quantifiées par spectroscopie UV-vis, et caractérisées par MALDI-TOF. Les brins obtenus ont ensuite été (1) 5′-phosphorylés et caractérisés par MALDI-TOF ; 2° traité avec Xrn-1; 3° filtré et dessalé; (4) analysé via MALDI-TOF. Cette configuration expérimentale a conduit à l’identification sans équivoque des fragments associés au décrochage de Xrn-1 : [5′-H2PO4-(8-oxoG)G CUA AAA GU], [5′-H2PO4-(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU], et [5′-H2PO4-(8-oxoG) CUA AAA GU]. Les expériences décrites ont été réalisées avec 200 picomols d’ARN (20 pmol utilisés pour les analyses MALDI); cependant, des quantités plus faibles peuvent entraîner des pics détectables avec des spectromètres utilisant des sources laser plus puissantes que celle utilisée dans ce travail. Il est important de noter que la méthodologie décrite peut être généralisée et potentiellement étendue à l’identification de produits pour d’autres processus impliquant de l’ARN et de l’ADN, et peut aider à la caractérisation / élucidation d’autres voies biochimiques.
Introduction
MALDI-TOF 1,2,3 est une technique largement utilisée pour la caractérisation et/ou la détection de molécules de tailles et de caractéristiques variables. Certaines de ses utilisations comprennent diverses applications telles que la détection de tanins à partir de ressources naturelles4, l’imagerie des métabolites dans les aliments5, la découverte ou la surveillance de cibles ou de marqueurs de médicaments cellulaires6, et les diagnostics cliniques7, pour n’en nommer que quelques-uns. L’utilisation de MALDI-TOF avec de l’ADN ou de l’ARN, dont l’utilisation sur des oligonucléotides remonte à plus de trois décennies8, où plusieurs limitations ont été notées, est pertinente pour les présents travaux. Cette technique a maintenant évolué vers un moyen fiable et couramment utilisé pour caractériser les biopolymères9 et identifier/comprendre les réactions chimiques et biochimiques, par exemple, la caractérisation des sites platinés dans l’ARN10, l’identification des fragments d’ARN après le clivage des brins11,12, ou la formation de liaisons croisées protéine-ADN13 . Ainsi, il est utile d’illustrer et de mettre en évidence les aspects importants de l’utilisation de cette technique. Les bases de MALDI-TOF ont également été décrites au format vidéo14 et ne seront pas développées plus en détail ici. En outre, son application dans un contexte d’ADN ou de protéine a déjà été décrite et illustrée dans ledit format 15,16,17.
Le protocole de détection des fragments d’ARN formés après hydrolyse enzymatique est rapporté ici. Le modèle expérimental a été choisi sur la base d’une découverte récente publiée par notre groupe18, où MALDI-TOF a été utilisé pour déterminer la réactivité unique entre l’exoribonucléase Xrn-1 et les oligonucléotides de l’ARN contenant la lésion oxydative 8-oxoG. Les 20-nucléotides longs brins ont été obtenus par synthèse en phase solide19, [5′-CAU GAA ACA A(8-oxoG)G CUA AAA GU] et [5′-CAU GAA ACA A(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU], tandis que Xrn-1 a été exprimé et purifié suite au rapport20 décrit précédemment. En bref, Xrn-121 est une exoribonucléase de 5′-3′ avec divers rôles biologiques clés qui dégradent plusieurs types d’ARN, y compris l’ARNoxydé 22. Il a été constaté que la processivité de l’enzyme se bloque lors de la rencontre du 8-oxoG, ce qui conduit à des fragments d’ARN contenant des extrémités 5′-phosphorylées [5′-H2PO4-(8-oxoG)G CUA AAA GU], [5′-H2PO4-(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU], et [5′-H2PO4-(8-oxoG) CUA AAA GU]18.
Enfin, il est important de noter que la spectrométrie de masse est une méthode puissante qui, grâce à diverses méthodologies, peut être adaptée à d’autres fins23,24; ainsi, le choix de la bonne méthode d’ionisation ainsi que d’autres installations expérimentales est de la plus haute importance.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le principal défi dans ce flux de travail s’est posé entre la finalisation des expériences et la réalisation des analyses spectrométriques de masse. Les expériences ont été menées et achevées à l’Université du Colorado à Denver et expédiées (pendant la nuit) aux installations de l’Université d’État du Colorado. L’acquisition des données a été effectuée dès réception, selon la commodité. Plusieurs circonstances inattendues ont entraîné des retards dans le processus. Dans un cas, des dys…
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il est important de noter que ce travail était un effort de collaboration entre trois institutions, deux groupes de recherche et une installation centrale. La distribution et la charge de travail ont été effectuées comme suit: L’expression de la protéine (Xrn-1) a été réalisée à l’Université de Denver (Denver, CO). La synthèse, la quantification et l’expérimentation d’oligonucléotides (principalement la dégradation enzymatique) ont été menées à l’Université du Colorado à Denver (Denver, CO). L’optimisation y a également été réalisée. La détection, l’acquisition et l’analyse de MALDI-TOF ont été effectuées à l’Analytical Resources Core Facility de la Colorado State University. (Fort Collins, CO). SS aimerait reconnaître un prix UROP (CU Denver) et des subventions Eureca (CU Denver) pour leur soutien. E. G.C. reconnaît le soutien de NIGMS, via R00GM115757. MJER reconnaît le soutien de NIGMS, via 1R15GM132816. K.B. reconnaît l’ID de ressource : SCR_021758. Le travail a également été soutenu par un Teacher-Scholar Award (MJER), TH-21-028, de la Fondation Henry Dreyfus.
Materials
| 0.6 mL MCT Graduated Violet | Fisher Scientific | 05-408-127 | |
| 6’-Trihydroxyacetophenone monohydrate 98% | Sigma Aldrich | 480-66-0 | |
| Acetonitrile 99.9%, HPLC grade | Fisher Scientific | 75-05-8 | |
| Adenosine triphosphate, 10 mM | New Englang Bioscience | P0756S | |
| Ammonium citrate, dibasic 98% | Sigma Aldrich | 3012-65-5 | |
| Ammonium Fluoride 98.0%, ACS grade | Alfa Aesar | 12125-01-8 | |
| Bruker bacterial test standard | Bruker Daltonics | 8255343 | |
| Commercial source of Xrn-1 | New England BioLabs | M0338S | |
| Diethyl pyrocarbonate, 97% | ACROS Organics | A0368487 | |
| Flex analysis software | Bruker daltonics | FlexAnalysis software version 3.4, Bruker Daltonics | |
| Lambda 365 UV-vis spectrophotometer | Perkin Elmer | ||
| MALDI plate: MSP 96 ground steel target | Bruker Daltonics | 280799 | |
| Mass Spectrometer | Bruker | Microflex LRFTOF mass spectrometer (Bruker Daltonics, Billerica, MA) | |
| Mili-Q IQ 7000 | Milipore Sigma | A Mili-Q system was used to purify all water used in this work | |
| Nanosep Centrifugal Devices with OmegaTM Membrane 10 K, blue (24/pkg) | Pall Corporation | OD010C33 | filter media, Omega (modified polyethersulfone) 10 K pore size |
| NEBuffer 3 | New England Biolabs | B7003S | This is solution B |
| Oligo Analyzer tool | IDT-DNA | https://www.idtdna.com/calc/analyzer | |
| Pipette tips P10 | Fisher Scientific | 02-707-441 | |
| Pipette tips P200 | Fisher Scientific | 02-707-419 | |
| RNase Away | Molecular BioProducts | 7005-11 | |
| T4 Polynucleotide Kinase | New England BioLabs | M0201S | |
| T4 Polynucleotide Kinase Reaction Buffer | New England BioLabs | B0201S | This is solution A |
| Triflouroacetic Acid | Alfa Aesar | 76-05-1 | |
| Xrn-1 exoribonuclease | Expressed in house | See ref. 20 | |
| ZipTip Pipette Tips for Sample preparation | Millipore | ZTC 18S 096 | 10 µL pipette tips loaded with a C18 standard 0.6 µL bed |
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