Quantifier les interactions de liaison entre le Cu(II) et les résidus peptidiques en présence et en absence de chromophores

La biologie a évolué pour utiliser la chimie diversifiée des ions métalliques nécessaires à l’adaptation et à la survie de la vie dans son environnement. On estime que 25% à 50% des protéines utilisent des ions métalliques pour la structure et la fonction¹. Le rôle particulier et l’état redox de l’ion métallique sont directement liés à la composition et à la géométrie des ligands biologiques qui le coordonnent. En outre, les ions métalliques redox-actifs tels que Cu(II) doivent être étroitement régulés de peur qu’ils n’interagissent avec les agents oxydants via une chimie de type Fenton pour former des espèces réactives de l’oxygène (ROS)^2,3,4. Comprendre les modes de liaison et l’affinité qui sous-tendent sa biochimie devrait aider à élucider le rôle biologique de l’ion métallique.

De nombreuses techniques sont utilisées pour étudier les interactions de liaison des métaux et des peptides. Il s’agit principalement de techniques spectroscopiques, mais elles comprennent également des simulations informatiques utilisant la dynamique moléculaire, comme en témoignent les interactions Cu(II) avec un fragment de bêta-amyloïde (Aβ)⁵. Une technique spectroscopique largement utilisée et accessible à de nombreuses universités est la résonance magnétique nucléaire (RMN). En utilisant la nature paramagnétique de Cu(II), Gaggelli et al. ont pu montrer où l’ion métallique se lie sur un pétide par relaxation des noyaux voisins⁶. La résonance paramagnétique électronique (EPR) peut également être utilisée pour sonder l’emplacement et le mode de liaison des ions métalliques paramagnétiques⁷. D’autres techniques spectroscopiques telles que le dichroïsme circulaire (CD) peuvent décrire la coordination autour de Cu(II) dans des systèmes tels que les systèmes tripeptides⁸, et la spectrométrie de masse peut montrer la stœchiométrie et les résidus auxquels l’ion métallique est coordonné par des modèles de fragmentation ^9,10.

Certaines de ces techniques, telles que la RMN, sont sans étiquette, mais nécessitent de grandes concentrations de peptides, ce qui pose des défis pour l’étude. Une autre technique courante appelée spectroscopie de fluorescence a été utilisée pour relier la position d’une tyrosine ou d’un tryptophane à la trempe à partir d’un Cu(II)^11,12. De même, cette technique peut montrer des changements structurels à la suite de la liaison Cu(II)¹³. Cependant, les défis avec ces études de liaison métal-peptide sont qu’ils sondent les acides aminés chromophoriques tels que la tyrosine que tous les systèmes n’ont pas, que l’ion métallique se lie sous un modèle classique, et que la technique peut ne pas être propice dans des conditions physiologiques. En effet, plusieurs peptides émergent qui ne contiennent pas de tels acides aminés chromophoriques ou se lient selon les modèles classiques, empêchant l’utilisation de ces techniques^14,15. Cet article détaille les approches pour évaluer les propriétés de liaison dans ces scénarios dans des conditions physiologiquement pertinentes.

Les ligands biologiques peuvent adopter différents états de protonation qui peuvent affecter la liaison aux ions métalliques tels que l’anneau imidazole sur l’histidine. Si le pH n’est pas maintenu de manière constante, les résultats peuvent être alambiqués ou contradictoires. Pour cette raison, les tampons sont un composant essentiel dans l’étude des interactions métal-protéine/peptide. Cependant, il a été démontré que de nombreux tampons interagissent favorablement avec les ions métalliques^16,17. En plus de rivaliser avec la molécule biologique d’intérêt, le tampon peut avoir des atomes de coordination similaires qui peuvent être difficiles à distinguer des atomes de coordination du peptide ou de la protéine. Dans cette étude, l’accent est mis sur la spectroscopie d’absorption électronique et la calorimétrie de titrage isotherme (ITC) en tant que deux techniques complémentaires pour étudier les interactions Cu(II)-peptide, avec des considérations particulières concernant le choix du tampon.

La spectroscopie d’absorption électronique est une technique rapide et largement accessible pour étudier les interactions de liaison des métaux. L’irradiation avec de la lumière dans les longueurs d’onde ultraviolettes (UV) ou visibles peut entraîner l’absorption de bandes d-d centrées sur le métal, qui fournissent des informations précieuses sur la classification des ligands, les géométries des métaux et les affinités de liaison apparentes^18,19. Pour ces complexes, les titrages directs d’ions métalliques dans des solutions protéiques ou peptidiques peuvent quantifier les stœchiométries de liaison et les affinités de liaison apparentes. Dans certains cas, comme les configurations d’électrons d⁵ ou d¹⁰, le complexe n’absorbe pas la lumière (c.-à-d. est spectroscopiquement silencieux). Dans ces complexes de métaux de transition spectroscopiquement silencieux, ces limitations peuvent être contournées en utilisant un ligand concurrent qui, lors de la coordination avec l’ion métallique, donne des bandes de transfert de charge détectables. Dans les deux cas, cette approche se limite à quantifier uniquement la stœchiométrie et l’affinité de liaison apparente, et aucun aperçu de l’enthalpie de liaison n’est fourni sans approximations.

Complétant les informations obtenues par spectroscopie d’absorption électronique, l’ITC est une technique attrayante pour la quantification directe et rigoureuse de l’enthalpie de liaison²⁰. L’ITC mesure directement la chaleur libérée ou consommée lors d’un événement de liaison et, puisque le titrage a lieu à pression constante, la chaleur mesurée est l’enthalpie de tous les équilibres (ΔH_ITC). De plus, la stœchiométrie de l’événement de liaison (n) et l’affinité de liaison apparente (K_ITC) sont quantifiées. À partir de ces paramètres, l’énergie libre (ΔG_ITC) et l’entropie (ΔS_ITC) sont déterminées, fournissant un instantané thermodynamique de l’événement de liaison. Comme il ne repose pas sur l’absorption de la lumière, l’ITC est une technique idéale pour les espèces spectroscopiquement silencieuses, par exemple, les complexes d’ions métalliques d⁵ ou d¹⁰ . Cependant, étant donné que la calorimétrie mesure la chaleur, tout système tampon non apparié et tout équilibre non comptabilisé peuvent nuire à l’analyse visant à déterminer avec précision la thermodynamique de liaison aux ions métalliques, et il faut prendre grand soin de traiter ces facteurs²⁰. S’il est effectué avec la rigueur appropriée, l’ITC est une technique robuste pour déterminer la thermodynamique des complexes métal-protéine/peptide.

Ici, un peptide de liaison au cuivre chromophoriquement silencieux, le C-peptide, est utilisé pour démontrer l’utilisation complémentaire des deux techniques. Le peptide C est un produit de clivage de 31 résidus (EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQ) formé pendant la maturation de l’insuline; il manque de résidus chromophoriques mais il a été démontré qu’il lie le Cu(II) avec une affinité physiologiquement pertinente^14,15. Le site de liaison Cu(II) est constitué des chaînes latérales d’un glutamate et d’un aspartate ainsi que du N-terminus du peptide^14,15. Ces atomes de coordination ressemblent beaucoup à ceux de nombreux systèmes tampons couramment utilisés. Ici, l’utilisation en tandem des bandes d-d et de transfert de charge en spectroscopie d’absorption électronique et ITC dans la quantification de la thermodynamique de liaison Cu(II) au peptide C est montrée. L’approche de l’étude de la liaison Cu(II) au peptide C peut être appliquée à d’autres ions métalliques et systèmes protéine/peptide.