Membranla İlişkili Makromolekül Dinamiğini Karakterize Etmek için Kütleye Duyarlı Partikül İzleme

Akış odacıklarında desteklenen lipit çift katmanlarının (SLB’ler) hazırlanması için buradaki ayrıntılı protokolü takiben (Şekil 1), görüntülenen tüm koşulların doğal görünümünde benek benzeri bir desen açıkça tanınabilir (Şekil 2). Bu etki, genellikle saçılma sinyaline hakim olan ve görsel olarak ayırt edilemeyen koşullara (cam, SLB’li cam veya SLB ve bağlı proteinler) yol açan camın yüzey pürüzlülüğünden kaynaklanır. Bununla birlikte, veziküllerin varlığı, veziküllerin geniş saçılma kesiti nedeniyle açıkça belirgindir ve vezikül kopmasının ve homojen membranlara füzyonun gözlemlenmesini sağlar (Şekil 2B ve Ek Film 1). Cam yüzeyin statik saçılma sinyalini, görüş alanı 24,25 içindeki dinamik elemanları vurgulayan oranmetrik bir yaklaşımla ortadan kaldırırken, boş bir SLB (Şekil 2C) veya camın kendisi (Şekil 2A) gürültülü bir görüntü olarak görünürken, membran üzerinde yayılan etiketsiz proteinler (Şekil 2D) ortaya çıkarılabilir. MSPT ölçümlerinin doğal arka planı, her piksel değerinin aynı görüntü konumunda filmin önceki ve sonraki piksellerinin medyanı boyunca bölünmesiyle yerel olarak tahmin edilebilir (Şekil 3). Sonuç olarak, makromoleküller, membran üzerindeki hareketi gözlemlenebilen, izlenebilen ve nicelleştirilebilen izotropik nokta yayılma fonksiyonları (PSF’ler) olarak ortaya çıkar. Aslında, hem kontrastın hem de dinamik davranışın mevcudiyeti, bir parçacığın moleküler boyutunun, parçacığı etiketlemeye gerek kalmadan, ilgili difüzyon davranışıyla doğrudan ilişkisini sağlar. Bununla birlikte, MSPT deneyleri sırasında belirlenen iSCAT kontrastını yorumlamak için, sinyal genliğini moleküler kütleye çeviren bir kalibrasyon yapmak önemlidir. Bu, bilinen kütlenin biyomoleküllerinin bir biyotin-streptavidin-biyotin kompleksi aracılığıyla bir SLB’ye bağlanmasıyla elde edilebilir (Şekil 4A). Örnek bir strateji olarak, sığır serum albümini (BSA), protein A (prA), alkalen fosfataz (AP) ve fibronektinin (FN) biyotinile varyantları kullanılabilir; bunlar, membrandaki biyotin içeren lipitlere (Biotinyl Cap PE) bağlı olan streptavidin’e (STP) bağlanır. Şekil 4A’da gösterildiği gibi, bu örnek makromoleküllerin giderek daha belirgin hale gelen kontrastı, ilgili biyotinillenmiş standartların artan moleküler ağırlığını yansıtmaktadır. Kontrast histogramlarının her bir tepe noktasının (Şekil 4B) standart proteinin oligomer durumunun karşılık gelen kütlesine atanmasıyla, kontrast ve kütle arasındaki doğrusal bir ilişki21,22 ortaya çıkar ve daha sonra bilinmeyen makromolekül sistemlerinin analizi için kullanılabilir (Şekil 4C). MSPT’nin moleküler ağırlıkları analiz etmek ve dolayısıyla oligomer durumlarını ve oligomerizasyon olaylarını incelemek için uygulanabilirliğini ve yeteneklerini gösteren iyi bir örnek, biyotinillenmiş aldolaz ve biyotinillenmiş IgG’nin dikkate alınmasıdır (Şekil 5). Aldolazın yaygın olarak homotetramer32 olduğu bildirilmektedir. Bununla birlikte, MSPT tarafından çözülen kütle dağılımı, çoklu popülasyonların varlığını vurgulayan dört ayrı tepe noktasına sahiptir (Şekil 5A). İlk minör tepe noktası boş streptavidin’e karşılık gelir ve bu tür deneylerdeki konfigürasyon nedeniyle beklenebilirken, sadece iki alt birim (2SU) veya altı alt birim (6SU) içeren aldolaz kompleksleri de aynı şekilde tespit edilebilir (Şekil 5B). İlginçtir ki, tetra ve heksamerik aldolaz-streptavidin kompleksleri, tek başına dimerik aldolaz ve streptavidin ile karşılaştırıldığında, örneğin ikinci bir biyotinile lipitin streptavidin’e bağlanması yoluyla artan viskoz bir sürüklenmeyi gösteren azaltılmış bir difüzyon katsayısı gösterir. Benzer şekilde, biyotinile IgG, kütle dağılımında üç tepe noktası sergiler ve ilk tepe yine tek bir streptavidinin kütlesiyle eşleşir. En bol zirvenin kütlesi, bir hafif ve bir ağır zincirin (1SU) kütlesine, yani bir IgG antikorunun yarısına karşılık gelir. İki özdeş yarıya (2SU) sahip tam antikor, vakaların yaklaşık% 11’inde tespit edilir. Difüzyon katsayısının artan karmaşık boyutlarla azalması, streptavidinin birden fazla biyotinile lipit veya ekli IgG’nin neden olduğu ek sürtünme veya her ikisi ile etkileşimlerini gösterir. Membrana bağımlı oligomer durumlarının tek analizinin yanı sıra, MSPT ayrıca ilgilenilen bir makromolekülün difüzyon davranışını oligomer durumuyla ilişkilendirmenin özel avantajını da sağlar. Bu tip analizler için temsili sonuçlar, membrana dahil edilen sırasıyla dioleoylfosfatidilserin (DOPS) veya glikozfingolipidlere (GM1) bağlanan ek V (AnV) ve kolera toksini alt birimi B (CTxB) için gösterilmiştir (Şekil 6A). Her iki çekirdek yoğunluğu tahmini (KDE’ler), benzer difüzyon davranışına sahip tek bir bol türü gösteren tek modal kütle ve difüzyon dağılımlarına sahiptir. Moleküler kütle ve difüzyon katsayısının tepe pozisyonu, AnV için sırasıyla 49.8 ± 2.2 kDa ve 1.4 ± 0.1 μm 2 / s ve CTxB için sırasıyla 62.7 ± 3.1 kDa ve 0.4 ± 0.1 μm2 / s olarak bulunmuştur. Ölçülen difüzyon katsayıları, yüksek hızlı AFM ve FRAP33,34’ten elde edilen daha önce bildirilen değerlerle karşılaştırılabilir. Beklenen makromolekülün kütlesine kıyasla hafifçe azalmış kütle (bir AnV trimeri için 52 kDa, bir CTxB pentamer için 65 kDa), toplulukta daha az alt birime sahip daha küçük komplekslerin varlığını gösterebilir. Proteinler arasındaki kütle farkı küçük ve mikroskobun belirtilen tespit sınırına (≈50 kDa) yakın olsa da, difüzyon katsayıları önemli ölçüde farklılık gösterir. Örneğin, bir equimolar karışımda, karışımın difüzyonunu yalnızca AnV ve CTxB’nin dağılımıyla karşılaştırarak, AnV’nin membran üzerinde CTxB’den daha bol olduğu sonucuna varılabilir (Şekil 6B). Bununla birlikte, CTxB konsantrasyonu AnV konsantrasyonuna kıyasla iki katına çıkarsa, denge membran üzerindeki baskın protein olarak CTxB’ye doğru kaydırılır. AnV ve CTxB karışımları için gösterildiği gibi, MSPT sadece membranla ilişkili makromolekülleri moleküler ağırlıklarına göre ayırt etmekle kalmaz, aynı zamanda farklı makromolekül popülasyonlarının difüzyon davranışlarına göre ayırt edilmesini de sağlar. Tüm mikroskopi tekniklerinde olduğu gibi, istenen veri kalitesini elde etmek için bazı deneysel gereksinimler çok önemlidir. Bu bağlamda önemli bir örnek, iyice temizlenmiş örtü fişleridir. Genel olarak, bu mikroskopi ile ilgili tek moleküllü deneyler için bir ön koşul olarak kabul edilir, ancak MSPT numune safsızlıklarına karşı özellikle hassastır. Temizlenmemiş kapak kapaklarının cam yüzeyinden kaynaklanan artan saçılma, herhangi bir nicel iSCAT ölçümünü önler. Özellikle, yeterince temizlenmemiş cam üzerindeki artık kir veya toz parçacıkları bile, doğal görüntüleme modunda parlak noktalar olarak tanınabilen kayda değer görüntü bozulmalarına neden olabilir (Şekil 7A). Bu kusurlar, statik doğaları nedeniyle arka plan tahmini ile giderilse de, bir parçacığın kontrastının doğru bir şekilde belirlenmesi bozulabilir ve bu nedenle nicel analizini olumsuz yönde etkileyebilir. MSPT deneylerinde karşılaşılan bir diğer yaygın sorun, görüş alanı boyunca yüzen (turuncu ile çevrelenmiş) kalan veziküller veya membran üzerinde belirli bir konumda sıkışmış (mavi ile çevrelenmiş) ve büyük titreşimli saçılımcılar olarak görünen kaynaşmamış veziküllerdir (Şekil 7B). Film edinimine olan oluşumlarını ve girişimlerini en aza indirmek için, proteini eklemeden önce SLB’yi iyice yıkamanız ve taze hazırlanmış küçük unilamellar veziküller (SUV’lar) ve iki değerli katyon karışımlarının kullanılması önerilir. Kütleye duyarlı parçacık izleme deneylerinin tasarımı için dikkate alınması gereken bir faktör, membran arayüzü ile ilişkili makromoleküllerin yoğunluğudur. Membran üzerindeki yüksek parçacık yoğunlukları aslında iki nedenden dolayı sorunlara neden olabilir: i) Partikül algılamalarının ardışık çerçevelerden yörüngelere bağlanması belirsiz hale gelir ve bu nedenle hata olasılığını ve yanlış değerlendirilmiş difüzyon katsayılarını artırır. ii) Karşılık gelen PSF uyumlarının genliğinden çıkarılan parçacıkların kütlesi sistematik olarak hafife alınır ve statik arka plan sinyalinin dinamik parçacık sinyalinden ayrılması giderek zorlaştığı için kütle zirveleri genişler (Şekil 7C). Şu anda, MSPT videolarının elde edilmesi sürecinde veri kalitesinin görsel olarak değerlendirilmesi mevcut ticari mikroskoplarda zordur, çünkü edinme yazılımında uygulanan oranmetrik görünüm, burada ve referanslarda açıklanan medyan tabanlı algoritma yerine kütle fotometrisi21 için oluşturulan arka plan kaldırma işlemini kullanmaktadır24,25 (Şekil 7D) ). İniş moleküllerini kütle fotometrisinde görselleştirmek için kullanılan ortalama tabanlı sürekli arka plan kaldırma, yayılan parçacıkların parlak kuyruklara sahip karanlık cepheler olarak görünmesine neden olur, bu da lekelerin oldukça anizotropik görünmesini sağlar ve algılama prosedürü sırasında PSF uyumuna müdahale eder. Bu nedenle, elde etme yazılımında uygulanan ortalama tabanlı görüntü işlemenin kullanılması, membranlar üzerindeki difüzyon biyomoleküllerinin analizi için uygun değildir. Şekil 1: Kütleye duyarlı parçacık izleme (MSPT) ile protein-membran etkileşimlerini analiz etmek için gereken bireysel adımların proses akış diyagramı. MSPT ölçümlerine numune hazırlamak için, cam kapak slaytları iyice temizlenmeli ve bir oksijen plazması ile etkinleştirilmelidir. Numune akış odalarına monte edildikten sonra, desteklenen lipit çift katmanlı (SLB) oluşumu için küçük unilamellar veziküller (SUV’lar) hazırlanır ve arka plan saçılımını azaltmak için tüm reaksiyon tamponları filtrelenir. SUV’lar, akış odalarında lipit çift katmanları oluşturmak için eklenir. İsteğe bağlı olarak, vezikül rüptürünü teşvik etmek için SUV’lara Ca2 + iyonları gibi iki değerli katyonlar eklenebilir. Sonunda, ilgilenilen proteinin düşük konsantrasyonları reaksiyon odasına yıkanır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 2: MSPT ölçümleriyle ilgili örnek yüzeylerin doğal ve oranmetrik görünümü. Bir cam örtü slaytının (A) yüzey pürüzlülüğünün temsili görüntüleri, desteklenen bir lipit çift katmanının (B) oluşumu sırasında, sağlam bir desteklenen lipit çift katmanlı (C) ve bir SLB (D) üzerinde yeniden oluşturulan örnek proteinlerin oluşumu sırasında. Dört örneğin tümü, ölçümün kendisi sırasında erişilebilen yerel modda ve medyan tabanlı arka plan kaldırma işleminden sonra işlenmiş oranmetrik görüntüler olarak görüntülenir. Ölçek çubukları 1 μm’yi temsil eder. Veri analizi için (bkz. eşlik eden Jupyter not defteri; adım 9), aşağıdaki parametreler kullanılmıştır: medyan pencere boyutu (window_length) = 1001. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 3: MSPT veri toplama ve analizi için gereken aşamaların adım adım diyagramı. Kütle fotometresinde ilgilenilen örnek için veri toplanmasından sonra, filmler statik arka planı piksel bazında kayan medyan yaklaşımıyla kaldırmak için işlenir. Bundan sonra, aday parçacıklar, parçacık yörüngelerine bağlanmadan önce bir nokta yayılma fonksiyonu (PSF) ile tanımlanır ve takılır. Her parçacık için difüzyon katsayısının belirlenmesini sağlamak için, ortalama kare yer değiştirme (MSD) veya atlama mesafesi dağılımı (JDD) analizi kullanılır. Bu aşamada kontrast değerleri, kalibrasyon stratejisi ile belirlenen kontrast-kütle-ilişkisine göre moleküler kütlelere dönüştürülebilir. Son adım olarak, yörüngeler uzunluklarına veya membran parçacık yoğunluğuna göre filtrelenebilir ve iki boyutlu çekirdek yoğunluğu tahmini (2D-KDE) ile görselleştirilebilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 4: MSPT ölçümleri için kütle-kontrast ilişkisinin kalibrasyonu. (A) Biyotinile lipitlerin küçük bir yüzdesini içeren desteklenen bir lipit çift katmanı üzerine yayılan örnek streptavidin standardı protein kompleksleri için elde edilen temsili oranmetrik çerçeveler (DOPC: DOPG: Biotinyl Cap PE oranı% 70: 29.99: 0.01 mol). Model moleküler ağırlık standartları olarak, biyotinile sığır serumalbümini (BSA), biyotinile protein A (prA), biyotinile alkalen alkalen fosfataz (AP) veya biyotinile fibronektin (FN) ile kompleks halinde monovalan streptavidin 28 (sadece STP) veya iki değerli streptavidin28 gösterilmiştir. Aday noktalar turuncu (kesikli daireler) ile vurgulanır ve başarılı parçacık algılamaları kırmızı (düz daireler) ile vurgulanır. Ölçek çubukları 1 μm. (B) Beş model standart protein için elde edilen kontrast değerlerinin olasılık yoğunluk dağılımlarını temsil eder. Görüntülenen tüm veriler, koşul başına üç bağımsız deneyin havuzlanmış dağılımlarını temsil eder: STP yalnızca n = 82.719; BSA n = 9.034; prA n = 22.204; AP n = 69.065 ve FN n = 71.759 yörünge. Proteinli membranlar için belirlenen partikül sayılarıyla karşılaştırıldığında, boş bir çift katmanda tespit edilen parçacık sayısı orta derecede membran yoğunluklarında ihmal edilebilir düzeydedir (Ek Şekil 1). Kütle kalibrasyonu için dikkate alınan kontrast zirveleri sürekli çizgilerle işaretlenirken, kesikli olanlar dikkate alınmayan oligomer durumlarını temsil eder. (C) Panel D’deki tepe kontrastlarından ve komplekslerin ilgili dizi kütlelerinden türetilen kontrast-kütle kalibrasyon eğrisi. Hata çubukları, önyükleme ile tahmin edilen en yüksek konumların standart hatasını görüntüler (her biri 1.000 yörüngeye sahip 100 yeniden örnekleme). Veri analizi için (bkz. Jupyter notebook; adım 9), aşağıdaki parametreler kullanılmıştır: medyan pencere boyutu (window_length) = 1.001 kare, algılama eşiği (harman) = 0,00055, arama aralığı (dmax) = 4 piksel, bellek (max_frames_to_vanish) = 0 kare, minimum yörünge uzunluğu (minimum_trajectory_length) = 7 kare (yalnızca STP), 9 kare (BSA/FN), 15 kare (prA), 10 kare (AP). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 5: Membranla ilişkili proteinlerin oligomer durumlarının deşifre edilmesi . (A) Biyotinile aldolaz (sol panel) veya biyotin modifiye edilmiş keçi anti-Tavşan IgG antikoru (sağ panel) ile kompleks halinde tetravalan streptavidinin hem kütlesinin hem de difüzyon katsayısının 2D çekirdek yoğunluğu tahminleri. Her iki kompleksin sulandırılması, DOPC, DOPG ve Biotinyl Cap PE içeren desteklenen bir lipit çift katmanı üzerinde sırasıyla% 70:29.99: 0.01 mol oranında gerçekleştirilmiştir. Toplamda, streptavidin-aldolaz kompleksi (0.1 μm-2 parçacık yoğunluğu) ve streptavidin-IgG kompoziti (0.1 μm-2 parçacık yoğunluğu) için 348.405 bağımsız replikanın 116.787 yörüngesi dahil edilmiştir. Sadece iz uzunluğu en az beş kare olan parçacıklar dahil edildi. Hem moleküler kütlenin (üstte) hem de difüzyon katsayısının (sağda) marjinal olasılık dağılımları sunulmuştur. Her iki paneldeki siyah x, KDE’nin ilgili yerel maksimumunu işaretler. (B) Tetravalan streptavidin kompleksi için biyotin modifiye aldolaz (sol panel) veya biyotinile IgG (sağ panel) kompleksi için belirlenen oligomer kütlelerinin, dizi kütlelerine göre beklenen moleküler ağırlıklarla karşılaştırılması. SU kısaltması, çıkarların proteini alt birimi adına tanıtılmıştır. Hata çubukları, önyükleme ile tahmin edilen en yüksek konumların standart hatasını görüntüler (her biri 1.000 yörüngeye sahip 100 yeniden örnekleme). Veri analizi için (bkz. eşlik eden Jupyter not defteri; adım 9), aşağıdaki parametreler kullanılmıştır: medyan pencere boyutu (window_length) = 1.001 kare, algılama eşiği (harman) = 0,00055, arama aralığı (dmax) = 4 piksel, bellek (max_frames_to_vanish) = 0 kare, minimum yörünge uzunluğu (minimum_trajectory_length) = 5. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 6: Doğal membranla etkileşen proteinlerin ek V (AnV) ve kolera toksini alt birimi B’nin (CTxB) difüzyon davranışının çözülmesi. (A) Ek V (sol panel) ve kolera toksini alt birimi B’nin (sağ panel) hem kütle hem de difüzyon katsayısının 2D çekirdek yoğunluğu tahminleri. AnV ve CTxB membran sulandırması için, sırasıyla DOPS’a :20 mol DOPC ve GM1’e .99:0.01 mol DOPC lipid bileşimleri kullanılmıştır. AnV (0.1 μm-2 parçacık yoğunluğu) ve CTxB (0.2 μm-2 parçacık yoğunluğu) için toplam üç bağımsız replikanın 206.819 yörüngesi (0.2 μm-2 parçacık yoğunluğu) dahil edilmiştir. (B) CTxB ve AnV karışımlarının sırasıyla 1:1 (sol panel) veya 2:1 (sağ panel) oranında 2B çekirdek yoğunluğu tahminleri. Protein karışımlarının sulandırılması, DOPC, DOPS ve GM1 lipitleri içeren desteklenen bir lipit çift katmanı üzerinde% 80:19.99: 0.01 mol oranında gerçekleştirildi. 1:1 karışımı (0,1 μm-2 partikül yoğunluğu) için üç bağımsız replikanın toplam 42.696 yörüngesi ve 2:1 oranı (0,3 μm-2 parçacık yoğunluğu) için 264.561 yörünge dahil edilmiştir. Hem (A) hem de (B) için, yalnızca iz uzunluğu en az beş kare olan parçacıklar dahil edildi. Hem moleküler kütlenin (üstte) hem de difüzyon katsayısının (sağda) marjinal olasılık dağılımları sunulmuştur. Her paneldeki beyaz x, KDE’nin ilgili global maksimumunu gösterir. Veri analizi için (bkz. eşlik eden Jupyter not defteri; adım 9), aşağıdaki parametreler kullanılmıştır: medyan pencere boyutu (window_length) = 1.001 kare, algılama eşiği (harman) = 0,00055, arama aralığı (dmax) = 4 piksel, bellek (max_frames_to_vanish) = 0 kare, minimum yörünge uzunluğu (minimum_trajectory_length) = 5. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 7: MSPT ölçümleri sırasında veya veri analizi sırasında olası komplikasyonlar . (A) Temizlenmemiş bir kapak camı slaytının hem doğal hem de işlenmiş (medyan tabanlı arka plan kaldırma) oranmetrik görünümünde görüntülenen yüzey pürüzlülüğünün temsili görüntüleri. Her iki durumda da, parlak noktalar, artefaktsız ölçümleri engelleyen artık yüzey safsızlıklarını oluşturur. (B) Yetersiz membran yıkamasından sonra görüş alanındaki artık veziküllerin örnek görüntüleri. Hem statik (mavi renkle vurgulanmış) hem de dağınık (turuncu renkle vurgulanmış) veziküller, sırasıyla titreşim ve kıpırdanma veya yönlü hareketleri nedeniyle ölçüm kalitesini bozacaktır. (C) Tek parçacıklı bir teknik olarak MSPT, her parçacığın uygun şekilde bağlanmasını ve kütle tayini sağlamak için düşük parçacık yoğunlukları (temsili görüntü, üst panel) gerektirir. Yüksek membran-partikül yoğunlukları (orta panel) durumunda, kütle tayinini etkileyen partikül uyumu bozulur (bkz. alt panel). (D) Ortalama tabanlı (üst panel) veya medyan tabanlı arka plan çıkarılmasından sonra bir membran arayüzüne yayılan parçacıkların temsili oranmetrik görüntüleri. Parçacıkları dağıtmak için, ortalama tabanlı arka plan kaldırma stratejisi, üst ve orta panel arasındaki küçük iç kısımlarda görülebileceği gibi, parçacığın PSF’sinin bozuk görüntülerini üretir. Buna karşılık, bozulmamış parçacık PSF’leri medyan tabanlı yaklaşımla elde edilebilir. Alt panel: Ortalama veya medyan tabanlı arka plan kaldırma işleminden sonra elde edilen PSF’nin ortasından çizgi profillerinin karşılaştırılması. Bu şekilde görüntülenen tüm yerel ve oranmetrik görüntüler için, ölçek çubukları 1 μm’yi temsil eder. Veri analizi için (bkz. eşlik eden Jupyter not defteri; adım 9), aşağıdaki parametreler kullanılmıştır: medyan pencere boyutu (window_length) = 1.001 kare, algılama eşiği (harman) = 0,00055, arama aralığı (dmax) = 4 piksel, bellek (max_frames_to_vanish) = 0 kare, minimum yörünge uzunluğu (minimum_trajectory_length) = 5. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Ek Şekil 1: Proteinsiz ve işgal edilmiş membranların karşılaştırılması. Saflaştırılmış streptavidin (STP) ilavesinden önce (A) ve sonra (B) sağlam bir desteklenen lipit çift katmanının temsili görüntüleri. PSF modeline başarıyla uyan aday noktalar kırmızı renkle çevrilidir. (C) Boş bir zarda (membran arka planı, gri) ve yayılan streptavidin parçacıkları (mavi) olan bir çift katmanda tespit edilen parçacıkların kontrast olasılık dağılımları. Her iki olasılık dağılımı da aynı film toplama ve analiz parametrelerine sahip üç bağımsız deneyin havuzlanmış verilerini temsil eder. Veri analizi için (bkz. eşlik eden Jupyter not defteri; adım 9), aşağıdaki parametreler kullanılmıştır: medyan pencere boyutu (window_length) = 1.001 kare, algılama eşiği (harman) = 0,00055, arama aralığı (dmax) = 4 piksel, bellek (max_frames_to_vanish) = 0 kare, minimum yörünge uzunluğu (minimum_trajectory_length) = 7 kare. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız. Ek Film 1: Veziküllerin kopmasını ve kütle fotometresi ile kaydedilen homojen bir zara kaynaşmasını gösteren örnek film. Görüntü işleme medyan pencere boyutu (window_length) = 1.001 kare. Ölçek çubuğu: 1 μm. Kamera sayım aralığı: siyah = 16.892; beyaz = 65.408. Bu Filmi indirmek için lütfen tıklayınız. Ek Film 2: MSPT ölçümlerinden elde edilen ek V (üst) ve biyotinillenmiş aldolaz (alt) komplekslerinin bir çift katman üzerinde difüzyonunu gösteren örnek filmler. Görüntü işleme medyan pencere boyutu (window_length) = 1.001 kare. Ölçek çubuğu: 1 μm. İnterferometrik saçılma kontrast aralığı: siyah = -0,0075; beyaz = 0.0075. Bu Filmi indirmek için lütfen tıklayınız.