Massagevoelige deeltjestracking om membraangeassocieerde macromolecuuldynamica te karakteriseren

Volgens het gedetailleerde protocol hierin voor de bereiding van ondersteunde lipide bilayers (SLB’s) in stroomkamers (figuur 1), kan men duidelijk een spikkelachtig patroon herkennen in de oorspronkelijke weergave van alle weergegeven omstandigheden (figuur 2). Dit effect wordt veroorzaakt door de oppervlakteruwheid van het glas, die over het algemeen het verstrooiingssignaal domineert en leidt tot visueel niet van elkaar te onderscheiden omstandigheden (glas, glas met SLB of glas met SLB en aangehechte eiwitten). De aanwezigheid van blaasjes is echter duidelijk te onderscheiden door de grote verstrooiingsdoorsnede van de blaasjes en maakt de waarneming van blaasjesruptuur en fusie tot homogene membranen mogelijk (figuur 2B en aanvullende film 1). Bij het verwijderen van het statische verstrooiingssignaal van het glasoppervlak met een ratiometrische benadering die de dynamische elementen binnen het gezichtsveldbenadrukt 24,25, kan men ongelabelde eiwitten ontdekken die zich op het membraan verspreiden (figuur 2D) terwijl een lege SLB (figuur 2C) of glas zelf (figuur 2A) verschijnt als een luidruchtig beeld. De inherente achtergrond van MSPT-metingen kan lokaal worden geschat door elke pixelwaarde te delen door de mediaan van n voorafgaande en volgende pixels van de film op dezelfde beeldpositie (figuur 3). Als gevolg hiervan verschijnen macromoleculen als isotrope puntspreidingsfuncties (PSF’s) waarvan de beweging op het membraan kan worden waargenomen, gevolgd en gekwantificeerd. In feite maakt de beschikbaarheid van zowel contrast als dynamisch gedrag de directe relatie van de moleculaire grootte van een deeltje met zijn respectieve diffusieve gedrag mogelijk, allemaal zonder de noodzaak om het deeltje te labelen. Om het iSCAT-contrast te interpreteren dat tijdens MSPT-experimenten is bepaald, is het echter essentieel om een kalibratie uit te voeren die de signaalamplitude vertaalt in moleculaire massa. Dit kan worden bereikt door biomoleculen van bekende massa aan een SLB te hechten via een biotine-streptavidin-biotinecomplex (figuur 4A). Als voorbeeldige strategie kan men gebiotinyleerde varianten van runderserumalbumine (BSA), eiwit A (prA), alkalische fosfatase (AP) en fibronectine (FN) gebruiken, die binden aan streptavidin (STP) dat zelf gebonden is aan biotinebevattende lipiden (Biotinyl Cap PE) in het membraan. Zoals weergegeven in figuur 4A, weerspiegelt het steeds duidelijker wordende contrast van deze voorbeeldige macromoleculen het toenemende molecuulgewicht van de respectieve gebiotinyleerde normen. Door elke piek van de contrasthistogrammen (figuur 4B) toe te wijzen aan de overeenkomstige massa van de oligomeertoestand van het standaardeiwit, wordt een lineair verband tussen contrast en massaonthuld 21,22 en kan vervolgens worden gebruikt voor de analyse van onbekende macromolecuulsystemen (figuur 4C). Een goed voorbeeld dat de toepasbaarheid en mogelijkheden van MSPT aantoont om molecuulgewichten te analyseren en dus oligomeertoestanden en oligomerisatiegebeurtenissen te bestuderen, is de overweging van gebiotinyleerd aldolase en gebiotinyleerd IgG (figuur 5). Aldolase wordt vaak gemeld als een homotetrameer32. De massaverdeling die door MSPT wordt opgelost, heeft echter vier verschillende pieken, wat de aanwezigheid van meerdere populaties benadrukt (figuur 5A). Terwijl de eerste kleine piek overeenkomt met onbezette streptavidin en kan worden verwacht vanwege de configuratie in dit soort experimenten, kunnen aldolasecomplexen met slechts twee subeenheden (2SU) of zes subeenheden (6SU) ook worden gedetecteerd (figuur 5B). Interessant is dat tetra- en hexamere aldolase-streptavidin-complexen een verminderde diffusiecoëfficiënt vertonen in vergelijking met dimerische aldolase en streptavidin alleen, wat wijst op een verhoogde viskeuze weerstand, bijvoorbeeld via de aanhechting van een tweede gebiotinyleerd lipide aan de streptavidin. Evenzo vertoont gebiotinyleerd IgG drie pieken in de massaverdeling, waarbij de eerste piek weer overeenkomt met de massa van een enkele streptavidin. De massa van de meest voorkomende piek komt overeen met de massa van één lichte en één zware keten (1SU), d.w.z. de helft van een IgG-antilichaam. Het volledige antilichaam met twee identieke helften (2SU) wordt in ongeveer 11% van de gevallen gedetecteerd. De afname van de diffusiecoëfficiënt met toenemende complexe afmetingen duidt op interacties van de streptavidin met meer dan één gebiotinyleerd lipide of extra weerstand veroorzaakt door het bijgevoegde IgG, of beide. Naast de enige analyse van membraanafhankelijke oligomeertoestanden, verleent MSPT ook het bijzondere voordeel van het correleren van het diffusieve gedrag van een macromolecuul van belang met zijn oligomeertoestand. Representatieve resultaten voor dit type analyse worden getoond voor annexine V (AnV) en choleratoxine subeenheid B (CTxB), die binden aan respectievelijk dioleoylfosfatidylserine (DOPS) of glycosphingolipiden (GM1), opgenomen in het membraan (figuur 6A). Beide kerneldichtheidsschattingen (KDE’s) hebben unimodale verdelingen van massa en diffusie, wat wijst op een enkele overvloedige soort met vergelijkbaar diffusief gedrag. De piekpositie van moleculaire massa en diffusiecoëfficiënt bleek respectievelijk 49,8 ± 2,2 kDa en 1,4 ± 0,1 μm2/s te zijn voor AnV en 62,7 ± respectievelijk 3,1 kDa en 0,4 ± 0,1 μm2/s voor CTxB. De gemeten diffusiecoëfficiënten zijn vergelijkbaar met eerder gerapporteerde waarden verkregen uit high-speed AFM en FRAP 33,34. De licht gereduceerde massa in vergelijking met de massa van het verwachte macromolecuul (52 kDa voor een AnV-trimer, 65 kDa voor een CTxB pentameer) kan wijzen op de aanwezigheid van kleinere complexen met minder subeenheden in het ensemble. Hoewel het massaverschil tussen de eiwitten klein is en dicht bij de gespecificeerde detectiegrens van de microscoop ligt (≈50 kDa), verschillen hun diffusiecoëfficiënten aanzienlijk. In een equimolair mengsel, bijvoorbeeld door de diffusie van het mengsel te vergelijken met de verdeling van AnV en CTxB alleen, kan men concluderen dat AnV overvloediger aanwezig is op het membraan dan CTxB (figuur 6B). Als de concentratie van CTxB echter wordt verdubbeld in vergelijking met de concentratie van AnV, wordt het evenwicht verschoven naar CTxB als het overheersende eiwit op het membraan. Zoals geïllustreerd voor mengsels van AnV en CTxB, maakt MSPT het niet alleen mogelijk om membraangeassocieerde macromoleculen te onderscheiden op basis van hun molecuulgewicht, maar maakt het ook de discriminatie van verschillende macromolecuulpopulaties mogelijk op basis van hun diffusiegedrag. Zoals bij alle microscopietechnieken zijn enkele experimentele vereisten cruciaal om de gewenste kwaliteit van gegevens te bereiken. Een belangrijk voorbeeld in dit verband zijn grondig gereinigde coverslips. Over het algemeen wordt dit beschouwd als een voorwaarde voor microscopie-gerelateerde experimenten met één molecuul, maar MSPT is bijzonder gevoelig voor onzuiverheden in het monster. De verhoogde verstrooiing afkomstig van het glasoppervlak van ongereinigde coverslips verhindert elke kwantitatieve iSCAT-meting. Met name kan zelfs achtergebleven vuil of stofdeeltjes op onvoldoende gereinigd glas opmerkelijke beeldvervormingen veroorzaken, herkenbaar als heldere vlekken in de oorspronkelijke beeldvormingsmodus (figuur 7A). Hoewel deze defecten worden verwijderd door de achtergrondschatting vanwege hun statische aard, kan een nauwkeurige bepaling van het contrast van een deeltje worden aangetast en dus de kwantitatieve analyse negatief beïnvloeden. Een ander veel voorkomend probleem in MSPT-experimenten zijn de resterende blaasjes die ofwel zweven (omringd in oranje) door het gezichtsveld of niet-toegediende blaasjes die vastzitten (omcirkeld in blauw) op een specifieke positie op het membraan en verschijnen als grote pulserende verstrooiers (figuur 7B). Om hun voorkomen en interferentie met filmacquisitie te minimaliseren, wordt aanbevolen om de SLB grondig te wassen voordat het eiwit wordt toegevoegd en om vers bereide mengsels van kleine unilamellaire blaasjes (SUV’s) en tweewaardige kationen te gebruiken. Een factor waarmee rekening moet worden gehouden bij het ontwerpen van massagevoelige deeltjesvolgexperimenten is de dichtheid van macromoleculen die verband houden met de membraaninterface. Hoge deeltjesdichtheden op het membraan kunnen in feite om twee redenen problemen veroorzaken: i) Het koppelen van deeltjesdetecties van opeenvolgende frames in trajecten wordt dubbelzinnig en verhoogt daarom de kans op fouten en verkeerd ingeschat diffusiecoëfficiënten. ii) De massa deeltjes, die wordt geëxtraheerd uit de amplitude van hun overeenkomstige PSF-fit, wordt systematisch onderschat en massapieken worden groter omdat de scheiding van het statische achtergrondsignaal van het dynamische deeltjessignaal steeds moeilijker wordt (figuur 7C). Momenteel is visuele beoordeling van de gegevenskwaliteit in het proces van het verwerven van MSPT-video’s moeilijk op de beschikbare commerciële microscopen omdat de geïmplementeerde ratiometrische weergave in de acquisitiesoftware de achtergrondverwijdering gebruikt die is vastgesteld voor massafotometrie21 in plaats van het op medianen gebaseerde algoritme dat hier en in referenties24,25 wordt beschreven (figuur 7D ). De op gemiddelde gebaseerde continue achtergrondverwijdering die wordt gebruikt om landingsmoleculen in massafotometrie te visualiseren, zorgt ervoor dat diffuserende deeltjes verschijnen als donkere fronten met heldere staarten, waardoor de vlekken zeer anisotroop lijken en de PSF-aanpassing tijdens de detectieprocedure verstoort. Het gebruik van de geïmplementeerde mean-based beeldverwerking in de acquisitiesoftware is dus ongeschikt voor de analyse van diffuserende biomoleculen op membranen. Figuur 1: Processtroomdiagram van de afzonderlijke stappen die nodig zijn om eiwit-membraaninteracties te analyseren met massagevoelige deeltjestracering (MSPT). Om monsters voor te bereiden op MSPT-metingen, moeten glasdekplaten grondig worden gereinigd en geactiveerd met een zuurstofplasma. Na hun assemblage in monsterstroomkamers worden kleine unilamellaire blaasjes (SUV’s) voorbereid op ondersteunde lipide bilayer (SLB) vorming en worden alle reactiebuffers gefilterd om achtergrondverstrooiing te verminderen. SUV’s worden toegevoegd om lipide bilayers te vormen in de stroomkamers. Optioneel kunnen tweewaardige kationen zoals Ca2+ ionen aan de SUV’s worden toegevoegd om vesikelruptuur te bevorderen. Ten slotte worden lage concentraties van het eiwit van belang in de reactiekamer gespoeld. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 2: Native en ratiometrische weergave van voorbeeldige oppervlakken die relevant zijn voor MSPT-metingen. Representatieve beelden van de oppervlakteruwheid van een glasdekplaat (A), tijdens de vorming van een ondersteunde lipide bilayer (B), met een intacte ondersteunde lipide bilayer (C) en van voorbeeldige eiwitten gereconstitueerd op een SLB (D). Alle vier de voorbeelden worden weergegeven in de native modus, die toegankelijk is tijdens de meting zelf, en als verwerkte ratiometrische afbeeldingen na mediane achtergrondverwijdering. Schaalbalken vertegenwoordigen 1 μm. Voor data-analyse (zie bijgeleverd Jupyter-notitieboek; stap 9) werden de volgende parameters gebruikt: mediane venstergrootte (window_length) = 1001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 3: Stapsgewijs diagram van de fasen die nodig zijn voor mspt-gegevensverzameling en -analyse. Na gegevensverzameling voor het interessante monster op de massafotometer worden films verwerkt om de statische achtergrond te verwijderen via een pixelgewijze glijdende mediane benadering. Daarna worden kandidaatdeeltjes geïdentificeerd en aangepast door een puntspreidingsfunctie (PSF) voordat ze worden gekoppeld aan deeltjestrajecten. Om de bepaling van de diffusiecoëfficiënt voor elk deeltje mogelijk te maken, wordt een gemiddelde kwadraatverplaatsingsanalyse (MSD) of sprongafstandsverdeling (JDD) gebruikt. In dit stadium kunnen contrastwaarden worden omgezet in moleculaire massa’s volgens de contrast-massa-relatie bepaald door de kalibratiestrategie. Als laatste stap kunnen trajecten worden gefilterd op basis van hun lengte of membraandeeltjesdichtheid en worden gevisualiseerd door tweedimensionale kerneldichtheidsschatting (2D-KDE). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 4: Kalibratie van de massa-contrastrelatie voor MSPT-metingen. (A) Representatieve ratiometrische frames verkregen voor voorbeeldige streptavidin-standaard eiwitcomplexen die diffunderen op een ondersteunde lipide bilaag die een klein percentage gebiotinyleerde lipiden bevat (DOPC:DOPG:Biotinyl Cap PE ratio van 70:29,99:0,01 mol%). Als modelmoleculaire gewichtsnormen worden monovalent streptavidin28 (alleen STP) of divalent streptavidin28 in complex met gebiotinyleerd runderserumalbumine (BSA), gebiotinyleerd eiwit A (prA), gebiotinyleerd alkalisch fosfatase (AP) of gebiotinyleerd fibronectine (FN) getoond. Kandidaatvlekken worden oranje gemarkeerd (onderbroken cirkels) en succesvolle deeltjesdetecties worden rood gemarkeerd (effen cirkels). De maatstaven vertegenwoordigen 1 μm. (B) Waarschijnlijkheidsdichtheidsverdelingen van contrastwaarden verkregen voor de vijf modelstandaardeiwitten. Alle weergegeven gegevens vertegenwoordigen gepoolde verdelingen van drie onafhankelijke experimenten per voorwaarde: STP alleen n = 82.719; BSA n = 9.034; prA n = 22.204; AP n = 69.065 en FN n = 71.759 trajecten. In vergelijking met deeltjesaantallen bepaald voor membranen met eiwitten, is het aantal deeltjes dat op een lege dubbellaag wordt gedetecteerd verwaarloosbaar bij matige membraandichtheden (aanvullende figuur 1). Contrastpieken die in aanmerking worden genomen voor massakalibratie worden gemarkeerd door ononderbroken lijnen, terwijl onderbroken pieken oligomeertoestanden vertegenwoordigen die niet in aanmerking worden genomen. (C) Contrast-tot-massakalibratiecurve afgeleid van piekcontrasten in paneel D en de respectieve sequentiemassa’s van de complexen. Foutbalken geven de standaardfout weer van de pieklocaties die worden geschat door bootstrapping (100 resamples met elk 1.000 trajecten). Voor data-analyse (zie Jupyter notebook; stap 9) zijn de volgende parameters gebruikt: mediane venstergrootte (window_length) = 1.001 frames, detectiedrempel (dorsen) = 0,00055, zoekbereik (dmax) = 4 pixels, geheugen (max_frames_to_vanish) = 0 frames, minimale trajectlengte (minimum_trajectory_length) = 7 frames (alleen STP), 9 frames (BSA/FN), 15 frames (prA), 10 frames (AP). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 5: Ontcijfering van oligomeertoestanden van membraangeassocieerde eiwitten. (A) Schattingen van de 2D-kerneldichtheid van zowel massa- als diffusiecoëfficiënt van tetravalent streptavidin in complex met gebiotinyleerd aldolase (linkerpaneel) of met een biotine-gemodificeerd geiten-anti-Konijn IgG-antilichaam (rechterpaneel). Reconstitutie van beide complexen is uitgevoerd op een ondersteunde lipide bilayer met DOPC, DOPG en Biotinyl Cap PE in een verhouding van respectievelijk 70:29,99:0,01 mol%. In totaal zijn 116.787 trajecten van drie onafhankelijke replicaties opgenomen voor het streptavidin-aldolasecomplex (deeltjesdichtheid van 0,1 μm-2) en 348.405 voor het streptavidin-IgG-composiet (deeltjesdichtheid van 0,1 μm-2). Alleen deeltjes met een spoorlengte van minstens vijf frames werden opgenomen. Marginale kansverdelingen van zowel molecuulmassa (boven) als diffusiecoëfficiënt (rechts) worden gepresenteerd. De zwarte x in beide panelen markeren de respectievelijke lokale maxima van de KDE. (B) Vergelijking van bepaalde oligomeermassa’s voor het complex van tetravalent streptavidin met biotine-gemodificeerd aldolase (linkerpaneel) of gebiotinyleerd IgG (rechterpaneel) met, afhankelijk van de sequentiemassa’s, verwachte molecuulgewichten. De afkorting SU wordt ingevoerd ten behoeve van de subeenheid protein of interests. Foutbalken geven de standaardfout weer van de pieklocaties die worden geschat door bootstrapping (100 resamples met elk 1.000 trajecten). Voor data-analyse (zie bijgeleverd Jupyter notebook; stap 9) werden de volgende parameters gebruikt: mediane venstergrootte (window_length) = 1.001 frames, detectiedrempel (dorsen) = 0,00055, zoekbereik (dmax) = 4 pixels, geheugen (max_frames_to_vanish) = 0 frames, minimale trajectlengte (minimum_trajectory_length) = 5. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 6: Het oplossen van het diffusiegedrag van de inheemse membraaninteragerende eiwitten annexine V (AnV) en cholera toxine subeenheid B (CTxB). (A) 2D kerneldichtheidsschattingen van zowel massa- als diffusiecoëfficiënt van annexine V (linkerpaneel) en choleratoxine subeenheid B (rechterpaneel). Voor AnV- en CTxB-membraanreconstitutie zijn lipidesamenstellingen van respectievelijk 80:20 mol% DOPC tot DOPS en 99,99:0,01 mol% DOPC tot GM1 gebruikt. In totaal zijn 206.819 trajecten van drie onafhankelijke replicaties opgenomen voor AnV (deeltjesdichtheid van 0,1 μm-2) en 142.895 trajecten voor CTxB (deeltjesdichtheid van 0,2 μm-2). (B) schattingen van de 2D-kerneldichtheid van CTxB- en AnV-mengsels in een verhouding van respectievelijk 1:1 (linkerpaneel) of 2:1 (rechterpaneel). Reconstitutie van eiwitmengsels werd uitgevoerd op een ondersteunde lipide bilayer met DOPC, DOPS en GM1 lipiden in een verhouding van 80:19.99:0.01 mol%. In totaal zijn 42.696 trajecten van drie onafhankelijke replicaties opgenomen voor het 1:1 mengsel (deeltjesdichtheid van 0,1 μm-2) en 264.561 trajecten voor de 2:1 verhouding (deeltjesdichtheid van 0,3 μm-2). Voor zowel (A) als (B) werden alleen deeltjes met een spoorlengte van ten minste vijf frames opgenomen. Marginale kansverdelingen van zowel molecuulmassa (boven) als diffusiecoëfficiënt (rechts) worden gepresenteerd. De witte x in elk paneel markeert het respectievelijke globale maximum van de KDE. Voor data-analyse (zie bijgeleverd Jupyter notebook; stap 9) werden de volgende parameters gebruikt: mediane venstergrootte (window_length) = 1.001 frames, detectiedrempel (dorsen) = 0,00055, zoekbereik (dmax) = 4 pixels, geheugen (max_frames_to_vanish) = 0 frames, minimale trajectlengte (minimum_trajectory_length) = 5. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 7: Mogelijke complicaties bij MSPT-metingen of tijdens data-analyse. (A) Representatieve beelden van de oppervlakteruwheid weergegeven in zowel de oorspronkelijke als de verwerkte (op mediaan gebaseerde achtergrondverwijdering) ratiometrische weergave van een ongereinigde afdekglasplaat. In beide gevallen vormen heldere vlekken resterende oppervlakteverontreinigingen die artefactvrije metingen belemmeren. (B) Voorbeeldbeelden van restblaasjes in het gezichtsveld na onvoldoende membraanwassing. Zowel statische (gemarkeerd in blauw) als diffuserende (gemarkeerd in oranje) blaasjes zullen de meetkwaliteit aantasten, hetzij door pulseren en wiebelen, hetzij door hun directionele beweging, respectievelijk. (C) Als een techniek met één deeltje vereist MSPT lage deeltjesdichtheden (representatief beeld, bovenste paneel) om een goede koppeling en massabepaling van elk deeltje mogelijk te maken. In het geval van hoge membraan-deeltjesdichtheden (middelste paneel) is de deeltjesfitting verminderd, wat de massabepaling beïnvloedt (zie onderste paneel). (D) Representatieve ratiometrische beelden van deeltjes die diffunderen op een membraaninterface na ofwel op gemiddelde (bovenste paneel) ofwel mediane achtergrondverwijdering. Voor diffuuserende deeltjes produceert de op gemiddelde achtergrond gebaseerde achtergrondverwijderingsstrategie vervormde beelden van de PSF van het deeltje, zoals te zien is in de kleine inzetstukken tussen het bovenste en middelste paneel. Daarentegen kunnen niet-verstoorde deeltjes-PSF’s worden verkregen via de mediaangebaseerde benadering. Onderste paneel: Vergelijking van lijnprofielen door het midden van de PSF verkregen na gemiddelde of mediane achtergrondverwijdering. Voor alle native en ratiometrische afbeeldingen die in deze figuur worden weergegeven, vertegenwoordigen de schaalbalken 1 μm. Voor data-analyse (zie bijgeleverd Jupyter notebook; stap 9) werden de volgende parameters gebruikt: mediane venstergrootte (window_length) = 1.001 frames, detectiedrempel (dorsen) = 0,00055, zoekbereik (dmax) = 4 pixels, geheugen (max_frames_to_vanish) = 0 frames, minimale trajectlengte (minimum_trajectory_length) = 5. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Aanvullende figuur 1: Vergelijking van eiwitvrije en bezette membranen. Representatieve beelden van een intacte ondersteunde lipide bilayer vóór (A) en na (B) de toevoeging van gezuiverde streptavidin (STP). Kandidaatspots die met succes op het model PSF zijn gemonteerd, zijn rood omcirkeld. (C) Contrasteer waarschijnlijkheidsverdelingen van deeltjes gedetecteerd op een leeg membraan (membraanachtergrond, grijs) en op een dubbellaags met diffuserende streptavidindeeltjes (blauw). Beide kansverdelingen vertegenwoordigen de gepoolde gegevens van drie onafhankelijke experimenten met identieke filmacquisitie- en analyseparameters. Voor data-analyse (zie bijgeleverd Jupyter notebook; stap 9) werden de volgende parameters gebruikt: mediane venstergrootte (window_length) = 1.001 frames, detectiedrempel (thresh) = 0,00055, zoekbereik (dmax) = 4 pixels, geheugen (max_frames_to_vanish) = 0 frames, minimale trajectlengte (minimum_trajectory_length) = 7 frames. Klik hier om dit bestand te downloaden. Aanvullende film 1: Voorbeeldige film die de breuk en fusie van blaasjes tot een homogeen membraan toont, vastgelegd met de massafotometer. Beeldverwerkingsmediaan venstergrootte (window_length) = 1.001 frames. Schaalbalk: 1 μm. Camera telt bereik: zwart = 16.892; wit = 65.408. Klik hier om deze film te downloaden. Aanvullende film 2: Voorbeeldfilms die de diffusie van annexine V (boven) en gebiotinyleerde aldolase (onder) complexen op een dubbellaagse complexen tonen zoals verkregen uit MSPT-metingen. Beeldverwerkingsmediaan venstergrootte (window_length) = 1.001 frames. Schaalbalk: 1 μm. Interferometrisch verstrooiingscontrastbereik: zwart = -0,0075; wit = 0,0075. Klik hier om deze film te downloaden.