Transplantation de microglies dérivées de cellules souches pluripotentes induites par l’homme dans le cerveau de souris immunocompétentes par voie transnasale non invasive

Tous les animaux utilisés dans cette étude ont été obtenus, logés, soignés et utilisés conformément aux « Principes directeurs pour le soin et l’utilisation des animaux dans le domaine des sciences physiologiques » publiés par la Société physiologique du Japon20, et avec l’approbation préalable du Comité des soins aux animaux de l’Université de Yamanashi (Yamanashi, Japon). 1. Préparation du milieu cellulaire, du milieu de transplantation et du mélange d’anesthésie Préparer le milieu cellulaire en ajoutant 10 % de sérum fœtal bovin et 0,1 % de pénicilline/streptomycine dans le DMEM. Préparer le milieu de transplantation en ajoutant hCSF1 (250 ng/mL) et hTGF-β1 (100 ng/mL) au milieu cellulaire. Préparer le mélange d’anesthésie pour injection intrapéritonéale en mélangeant 0,45 mL de chlorhydrate de médétomidine, 1,2 mL de midazolam et 1,5 mL de tartrate de butorphanol dans 11,8 mL de solution saline normale. 2. Préparation de l’iPSMG REMARQUE : Les iPSMG congelés (Table des matières) ont été conservés à -80 °C jusqu’à leur utilisation. Décongelez rapidement les cellules congelées dans un bain-marie à 37 °C. Faites tourbillonner les échantillons jusqu’à ce que toute la glace visible ait fondu. Ajouter l’iPSMG décongelé au milieu de culture chauffé à 37 °C. Ajouter 1 mL de cellules décongelées contenant un milieu (1 × 106 cellules) à 10 mL du milieu de culture. Centrifuger les cellules à 300 x g pendant 5 min pour obtenir une pastille de cellule. Après centrifugation, retirer tout surnageant sans perturber la pastille cellulaire. L’élimination complète du surnageant est souhaitable pour réduire la dilution de la concentration de cytokines dans le milieu de transplantation. Ajouter le milieu de transplantation pour obtenir une concentration cellulaire de 1 x 105 cellules/μL. Placez l’iPSMG sur de la glace et procédez immédiatement à la transplantation.REMARQUE: La préparation de l’iPSMG pour la transplantation est effectuée sur un banc propre pour éviter toute contamination. 3. Préparation de la souris pour la transplantation transnasale (Tsn) Nourrissez les souris mâles de type sauvage (C57BL/6J, âgées de 8 semaines) avec un régime alimentaire contenant du PLX5622 pendant 7 jours. À la fin du 7e jour, cessez le régime PLX et nourrissez les souris avec un régime normal jusqu’à la fin de l’étude.REMARQUE: PLX5622 contenant un régime alimentaire est préparé en ajoutant 1,2 g de PLX5622 dans 1 kg d’AIN-93G (Table des matériaux). 4. Transplantation transnasale de cellules 24 h après l’arrêt de l’alimentation PLX, peser les souris et les anesthésier à l’aide d’une injection intrapéritonéale du mélange d’anesthésie (0,2 mL/20 g). Une fois que les souris sont complètement anesthésiées selon l’évaluation par l’absence de réponse au réflexe de retrait de la pédale (pincement ferme des orteils), administrer 2,5 μL de hyaluronidase dans le PBS (100 U / mL) à 1 h avant Tsn d’iPSMG à chaque narine deux fois en utilisant une pointe de pipette de 10 μL pour augmenter la perméabilité de la muqueuse nasale. Après l’application de hyaluronidase, placez les souris en position couchée. Répétez l’étape 4.2 10 min avant la transplantation transnasale d’iPSMG. Appliquer 2,5 μL de suspension cellulaire dans une narine de la souris à l’aide d’une pointe de pipette de 10 μL. Placez la souris en position couchée pendant 5 minutes avant l’administration de la suspension cellulaire à l’autre narine. Répétez les étapes 4.5 et 4.6 quatre fois, en appliquant un volume total de 20 μL par animal. Placez la souris en position couchée sur un coussin chauffant à 37 °C jusqu’à ce qu’elle soit remise de l’anesthésie. À 48 h après l’arrêt de l’alimentation PLX, répétez à nouveau les étapes 4.1 à 4.7 sur les mêmes souris.REMARQUE: Il convient de noter que les iPSMG sont placés sur la glace pendant la transplantation. 5. Application des cytokines Anesthésier les souris par injection intrapéritonéale de mélange d’anesthésie (0,2 mL/20 g). Appliquer 2,5 μL du milieu de transplantation dans une narine de la souris à l’aide d’une pointe de pipette de 10 μL. Placez la souris en position couchée pendant 5 minutes avant d’administrer le milieu de transplantation à l’autre narine. Répétez les étapes 5.2 et 5.3 quatre fois, en appliquant un volume total de 20 μL par animal.REMARQUE: Il convient de noter que l’administration transnasale de milieu de transplantation (cytokines humaines) est nécessaire toutes les 12 heures pour la viabilité de l’iPSMG transplanté jusqu’à la fin de l’étude.